目的：　　甲状腺癌（Thyroid Carcinoma，TC）作为最常见的内分泌系统癌症，在过去的几十年里发病率不断上升。虽然BRAFV600E突变及RET/PTC染色质重排在TC病例中的作用已比较明确，但是其它遗传学事件还知之甚少，因此，寻找新的分子靶标指导早期诊断和进行靶向治疗具有非常重要的意义。TBX3基因，作为T-box转录因子家族的重要成员，在胚胎发育及癌症发生中具有重要功能，被报道在多种癌症中过量表达，通常扮演癌基因的角色，参与肿瘤发生的多种生物学行为。主要通过抑制p53的激活子p14ARF或CDK激酶抑制剂p21WAF1/CIP1，以p53依赖及非依赖的方式促进癌症发生，TBX3在甲状腺乳头状癌中的功能尚未见报道。本课题的主要目的是研究TBX3如何影响甲状腺乳头状癌（PTC）的发生、发展，探讨TBX3在PTC中异常表达存在的可能分子机制。　　方法：　　第一部分：研究TBX3在甲状腺乳头状癌临床标本中的表达情况及分析TBX3表达与临床病理特征的相关性。该部分主要从三个方面进行研究。首先，收集98例甲状腺乳头状癌病人组织，其中71例标本包含临近的癌旁组织。应用免疫组化法检测所有标本中TBX3的表达情况。其次，应用qRT-PCR及免疫印迹技术检测15对乳头状癌组织及对应癌旁组织中TBX3蛋白的表达情况；与此同时，提取5株甲状腺癌细胞系及1株正常甲状腺上皮细胞的蛋白，免疫印迹技术检测TBX3的表达程度。最后，将癌组织中TBX3表达水平与肿瘤分级和临床病理特征进行2检验，分析相关程度。　　第二部分：探讨TBX3蛋白异常表达对甲状腺乳头状癌细胞增殖行为的影响。一方面，在PTC细胞系中瞬时转染siTBX3或稳定感染TBX3敲减慢病毒，下调TBX3蛋白的表达，之后应用CCK8、克隆形成实验及流式细胞术分析增殖表型变化情况。另一方面，将稳定低表达TBX3的K1细胞接种至裸鼠背部皮肤两侧，定期观察及测定肿瘤体积变化，进一步用免疫组化分析方法检测TBX3、Ki-67的表达变化。为了探索TBX3影响PTC细胞增殖的分子机制，对野生型和敲减TBX3的细胞进行RNA-seq测序分析。qRT-PCR及免疫印迹方法对靶基因p57KIP2进行验证，观察TBX3蛋白对p57KIP2表达的影响。之后，通过Rescue实验，在TBX3低表达的K1细胞中，进一步敲减p57KIP2表达，检测增殖表型的变化。　　第三部分：首先，用生物信息学方法预测TBX3在p57KIP2编码基因CDKN1C启动子区存在的潜在结合位点。之后将设计的不同位点的CDKN1C启动子截短报告质粒与TBX3过表达质粒共转染293T细胞中，用虫荧光素酶活性实验初步筛选潜在结合区段。其次，通过内外源性ChIP及DNA-pull down实验精确确定TBX3结合于p57KIP2编码基因CDKN1C启动子的精确位点。进一步，CoIP实验检测TBX3与PRC2复合体及HDAC1/2物理上能否相互作用。最后，在过表达TBX3的K1细胞中，同时加入S-腺苷高半胱氨酸水解酶和HDAC1/2的抑制剂DZnep和TSA后，检测p57KIP2蛋白表达及细胞增殖表型。　　结果：　　第一部分：人甲状腺乳头状癌癌组织中，TBX3在mRNA和蛋白水平均呈现高表达，在癌旁组织中低表达甚至不表达。进一步分析发现TBX3的表达水平与淋巴结转移及TNM分期成正比（p＜0.001），与年龄、性别及肿瘤大小无关。与此一致的是，相对于正常甲状腺上皮细胞Nthy，TBX3在甲状腺乳头状癌细胞系K1和TPC-1中高表达。　　第二部分：TBX3影响PTC细胞系的增殖表型。体外实验表明：PTC细胞系中瞬时或稳定敲减TBX3蛋白后，细胞生长变慢，细胞周期阻滞于G1/S期。体内动物实验观察到，TBX3蛋白敲减后，裸鼠体内成瘤能力下降，肿瘤体积明显减小。高通量转录组测序分析发现一个新的与增殖变化密切相关的CKI分子，p57KIP2。在细胞中敲减或过表达TBX3后，p57KIP2表达水平相应的升高或降低。进一步的Rescue实验，观察到周期阻滞表型有了一定程度的回复，说明p57KIP2在PTC中作为TBX3的下游分子发挥功能。　　第三部分：TBX3直接转录调节p57KIP2表达。首先，通过虫荧光素酶及内外源性ChIP实验确定TBX3结合于p57KIP2编码基因CDKN1C启动子的-1297及-800位点处。其次，通过内外源性CoIP实验，验证TBX3与PRC2复合体及HDAC1/2物理上能够相互结合。最后，通过Rescue实验，发现抑制H3K27me3和HDAC1/2在复合物中的作用后，细胞过快增长的表型得以恢复，证明TBX3需要PRC2复合物及HDAC1/2发挥功能。　　结论：　　下调甲状腺乳头状癌细胞系中TBX3的表达将会延迟G1/S期的转变，减少体外细胞增殖及抑制体内成瘤。p57KIP2是TBX3控制PTC细胞增殖的一个新的下游靶基因。TBX3表达减少可以导致p57KIP2表达水平的上升，随后敲低p57KIP2亦可以恢复细胞周期阻滞的表型。在PTC临床样本中，TBX3的表达与肿瘤分型密切相关，而与p57KIP2的表达呈现负相关。机制研究表明TBX3直接结合在p57KIP2的编码基因CDKN1C的启动子区域，抑制其转录。此外，TBX3招募PRC2复合物的核心成分及组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2，共同实现转录抑制功能。总之，我们的研究说明：TBX3-p57KIP2轴参与细胞周期调节的新的功能和机制，也表明此过程中PRC2复合体及HDAC1/2的作用。