转移是肿瘤的恶性标志之一,也是导致临床治疗失败和患者死亡的最主要原因。nm23-H1基因是人类发现的第一个肿瘤转移抑制基因,其抑制肿瘤转移发生的机制十分复杂,许多机制目前尚未阐清。上皮细胞间质化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮性肿瘤细胞获得侵润和迁徙能力的重要方式。目前还没有关于肿瘤转移抑制基因nm23-H1与EMT之间相关性的报道。一些间接的证据显示nm23-H1与EMT之间存在着一定的联系。为了进一步阐述nm23-H1抑制肿瘤的分子机制,为寻找肿瘤转移治疗新的靶点,我们对于nm23-H1基因与肿瘤细胞上皮细胞间质化的相关性进行了研究,并对nm23-H1发挥作用的可能的信号传导通路进行了探讨。第一部分肿瘤转移抑制基因nm23-H1对于肺腺癌细胞上.皮细胞间质化的影响目的：研究转移抑制基因nm23-H1对于肺腺癌细胞系A549以及A549-99上皮细胞间质化的影响。方法：我们应用EMT诱导剂刺激细胞,使其发生EMT。应用nm23-H1siRNA和含有nm23-H1cDNA质粒的转染调节nm23-H1基因的表达水平,研究nm23-H1基因对于肿瘤细胞EMT的影响。通过观察形态学的变化确认nm23-H1基因对于EMT表型的影响；用划痕实验检测细胞的迁徙能力的变化；通过小室检测细胞侵袭能力的变化。应用western blot和免疫荧光的方法来检测EMT标志物蛋白水平表达的变化,应用Real-time PCR检测了EMT标志物mRNA水平的变化。我们还通过流式细胞仪检测了肺癌干细胞标志物以及细胞周期的改变。结果：细胞经过TGF-β1诱导后,细胞形态由多角形的典型上皮细胞形态转化成为纺锤形的间质细胞形态,细胞的迁移能力、侵袭能力增强。上皮细胞标志物E-cadherin蛋白和mRNA水平表达降低,间质细胞标志物β-catenin和fibronectin蛋白和mRNA水平表达增加。其他的EMT诱导剂如HGF、IL-6、血清等对于EMT标志物影响的结果相似,但不如TGF-β1明显。细胞nm23-H1基因沉默后,细胞经过相同条件的TGF-β1诱导EMT,细胞更易与获得间质细胞的特征。表现为纺锤形的间质细胞形态更加明显,细胞的迁移能力、侵袭能力增强。上皮细胞标志物E-cadherin蛋白和mRNA水平表达降低,间质细胞标志物P-catenin和fibronectin蛋白和mRNA水平表达增加,并同时获得某些肺癌干细胞的特征。对于细胞周期的影响不是十分明显。而当nm23-H1基因过表达或恢复表达后,则可以一定程度上逆转细胞EMT标志物的表达。结论：肿瘤转移抑制基因nm23-H1可以通过抑制肿瘤EMT的发生来发挥抑制肿瘤转移的作用。第二部分肿瘤转移抑制基因nm23-H1通过转录因子snail抑制肺腺癌细胞上皮细胞间质细胞转化目的：转录因子snail在调节EMT当中起到关键作用。研究转录因子snail是否对于肿瘤转移抑制基因nm23-H1抑制肺腺癌细胞上皮细胞间质化的过程。方法：应用western blot分别检测了nm23-H1沉默与过表达之后snail蛋白水平表达的变化,用Real-time PCR检测了nm23-H1基因沉默后mRNA水平的变化,应用双报告基因的方法研究了snail启动子的活性变化。其次应用snail siRNA和含有snail cDNA质粒转染细胞,确定snail是否影响nm23-H1基因对于EMT的抑制作用。通过western blot检测了EMT标志物蛋白的表达变化。结果：转移抑制基因nm23-H1沉默后,TGF-β诱导细胞EMT,转录因子snail在蛋白和mRNA水平表达增加,启动子活性增高。当nm23-H1过表达后,转录因子snail蛋白的表达水平减低。转录因子snail基因沉默后,只能部分逆转nm23-H1沉默后细胞EMT后蛋白标志物的变化；而当转染snail cDNA后,nm23-H1沉默对于某些间质标志物仍然有促进作用。显示出nm23-H1可以部分通过转录因子snail来发挥其抑制EMT的作用,但还可能通过其他的机制抑制肿瘤细胞EMT的发生。结论：肿瘤抑制基因nm23-H1可以部分通过转录因子snail抑制肿瘤EMT的发生,进而抑制肿瘤的转移,但是nm23-H1基因还可能通过其他因子来起作用。第三部分肿瘤转移抑制基因nm23-H1抑制肺腺癌细胞上皮细胞间质化信号通路的研究目的：研究细胞中信号传导通路在介导肿瘤转移抑制基因nm23-H1抑制肿腺癌细胞上皮细胞间质化中的作用,进一步揭示nm23-H1抑制肿瘤转移的机制。方法：应用了影响EMT较为重要的信号通路的抑制剂,用来筛选相关的信号通路,并用western blot检测了EMT标志物蛋白以及TGF-β和Src信号通路上的关键蛋白在应用抑制剂前后以及nm23-H1基因沉默前后表达的变化。我们还同时检测了nm23-H1作用蛋白STRAP基因沉默后EMT标志物蛋白以及TGF-β信号通路上的关键蛋白表达的变化。结果：nm23-H1基因沉默后,在相同的TGF-β1浓度下,TGF-β信号通路强度增加,Src蛋白的活性增加更明显;nm23-H1过表达后能够逆转相关蛋白的表达。信号通路抑制剂的结果显示,Src蛋白在nm23-H1基因抑制TGF-β诱导的EMT过程中发挥重要作用。此外,肿瘤抑制基因nm23-H1可以与STRAP协同作用抑制TGF-β1诱导的EMT。结论：肿瘤转移抑制基因nm23-H1可以通过负向调节TGF-β信号通路来抑制肿瘤细胞EMT的发生,Src蛋白在这一过程当中发挥了部分作用。