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研究背景近年来,全国人民生活水平不断提高,以及饮食结构改变,我国结直肠癌的发病率和死亡率呈上升趋势。大量临床研究证实中医药在延长结肠癌患者的生存期,降低复发风险,改善生活质量,减轻放化疗的毒副作用方面有着自己独特的优势。朴炳奎教授系首届全国名中医,擅于中西医结合治疗恶性肿瘤,临床经验丰富,疗效确切。他认为,结肠癌病因病机复杂,系正气内虚,脏腑功能失调,脾胃运化失司,导致气滞、血瘀、痰结、湿聚、热毒等相互胶结,日久积滞而成有形之肿块;故治疗当以健脾益肾、行气化湿、解毒抗癌为主。扶正调气方是朴炳奎教授治疗结肠癌的经验集萃,本团队前期运用Liquorice系统和复杂网络分析技术获得该复方药组（白术、山药、枳壳、益智仁）。许多研究亦表明,该药组中的有效成分能够抑制肿瘤细胞增殖。本研究以结肠癌细胞系（SW480、HCT116、HT29、CT26）及荷CT26结肠癌小鼠为研究对象,围绕PI3K/AKT/mTOR信号通路,对扶正调气方防治结肠癌的作用机制进行初步探索,为后续研究提供依据与思路。研究目的通过观察中药复方扶正调气方对结肠癌细胞系（SW480、HCT116、HT29、CT26）增殖、凋亡、侵袭和迁移及荷瘤小鼠的影响,探讨该复方通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制肠癌的可能作用机制。研究方法体外实验1.制备扶正调气方含药血清,观察扶正调气方含药血清对结肠癌细胞系增殖的影响,确定最佳给药浓度与给药时间;2.通过划痕实验研究扶正调气方对结肠癌细胞系迁移的影响;3.通过Transwell侵袭实验研究扶正调气方对结肠癌细胞系侵袭的影响;4.通过CCK8法检测扶正调气方含药血清、氟尿嘧啶、扶正调气方含药血清联合氟尿嘧啶对结肠癌细胞系增殖的影响;5.通过流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双染法测扶正调气方含药血清、以及扶正调气方含药血清联合化疗药氟尿嘧啶对结肠癌细胞系凋亡率的影响;6.通过Western Blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达,观察扶正调气方及其联合化疗的影响。体内实验构建荷CT26结肠癌小鼠模型,以等效剂量的氟尿嘧啶和扶正调气方联合氟尿嘧啶对荷CT26结肠癌小鼠进行干预,观察小鼠移植瘤体积、移植瘤质量,验证扶正调气方联合氟尿嘧啶对小鼠结肠癌的抑制作用。研究结果1.扶正调气方含药血清具有抑制结肠癌细胞系增殖的作用,且分别用不同浓度干预不同时间,作用效果不同。扶正调气方含药血清作用于SW480:作用浓度为5%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（6.44±1.66）%、（7.78±1.62）%、（4.88±1.57）%;作用浓度为 10%时,其 24h、48h、72h 的抑制率分别为（12.21±4.29）%、（9.18±1.86）%、（7.13±3.46）%;作用浓度为15%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（18.29±9.48）%、（16.31±7.11）%、（9.90±2.23）%;作用浓度为 20%时,其 24h、48h、72h 的抑制率分别为（7.01±1.66）%、（5.60±3.65）%、（7.56±3.27）%。扶正调气方含药血清作用于HT29:作用浓度为5%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（5.09±4.01）%、（5.62± 1.82）%、（4.38±3.06）%;作用浓度为 10%时,其 24h、48h、72h 的抑制率分别为（7.32±2.76）%、（1.78±5.52）%、（2.93±1.76）%;作用浓度为15%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（13.72±2.77）%、（8.25±1.34）%、（6.81±3.87）%;作用浓度为 20%时,其 24h、48h、72h 的抑制率分别为（12.21±3.22）%、（2.04±4.01）%、（6.11±3.59）%。扶正调气方含药血清作用于HCT116:作用浓度为10%时,其24h、48h、72h 的抑制率分别为（6.38±3.47）%、（4.34±1.92）%、（2.09±1.96）%;作用浓度为15%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（8.33± 1.33）%、（15.94±1.87）%、（6.18±0.25）%;作用浓度为20%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（19.07±3.17）%、（19.07±4.16）%、（10.43±2.22）%;作用浓度为 25%时,其 24h、48h、72h 的抑制率分别为（1.66±0.74）%、（5.35±2.75）%、（1.49±1.06）%。扶正调气方含药血清作用于CT26:作用浓度为10%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（0.77±0.61）%、（5.13±5.08）%、（14.60±1.09）%;作用浓度为 15%时,其 24h、48h、72h 的抑制率分别为（5.89±1.04）%、（3.86±0.97）%、（11.51±1.77）%;作用浓度为20%时,其24h、48h、72h的抑制率分别为（15.43±2.92）%、（14.56±5.24）%、（4.66±2.98）%;作用浓度为 25%时,其 24h、48h、72h 的抑制率分别为（0.88±1.19）%、（10.46±3.29）%、（10.35±5.70）%。据此,确定最佳干预时间均为24小时,SW480和HT29最佳作用浓度为15%,HCT116和CT26最佳作用浓度为20%。2.扶正调气方能够抑制结肠癌细胞系的迁移。采用最佳作用浓度含药血清、干预最佳作用时间时,SW480迁移率为（21.60±1.79）%,明显低于空白组（28.62±2.50）%和模型组（35.33±2.63）%,差异有统计学意义（p＜0.05）;HCT116迁移率为（17.15±3.39）%,明显低于空白组（29.37±2.36）%和模型组（30.91±1.80）%,差异有统计学意义（p＜0.05）;HT29迁移率为（4.53±2.96）%,明显低于空白组（11.17±2.08）%和模型组的（10.35±1.20）%,差异有统计学意义（p＜0.05）;CT26迁移率为（16.14±4.39）%,明显低于空白组（31.78±6.28）%和模型组（43.31±5.45）%,差异有统计学意义（p＜0.05）。3.扶正调气方具有抑制结肠癌细胞系侵袭的能力。采用最佳作用浓度含药血清、干预最佳作用时间时,SW480侵袭过膜细胞数为（116.50±25.83）明显小于空白组（272.83±51.45）,差异有统计学意义（p＜0.05）。HCT116侵袭过膜细胞数为（123.67±6.11）明显小于空白组（288.33±17.67）,差异有统计学意义（p＜0.05）。HT29侵袭过膜细胞数为（113.66± 14.50）小于空白组（178.34±14.01）,差异有统计学意义（p＜0.05）。CT26侵袭过膜细胞数为（189.34±18.56）明显小于空白组（481.32±61.86）,差异有统计学意义（p＜0.05）。4.扶正调气方联合5FU能够提升化疗对结肠癌细胞系增殖的抑制效果。采用最佳作用浓度含药血清、干预最佳作用时间时,扶正调气方联合5FU组对SW480抑制率为（45.36±6.52）%,优于5FU组（34.41 ±7.96）%和扶正调气方组（27.63±2.79）%;对 HCT116 抑制率为（42.24±9.25）%,优于 5FU 组（30.85±8.56）%和扶正调气方组（19.07±5.26）%;对 HT29 抑制率为（40.52±3.60）%,优于 5FU 组（27.85±4.27）%和扶正调气方组（24.33±1.30）%;对CT26抑制率为（48.60±1.66）%,优于5FU组（38.61±3.85）%和扶正调气方组（15.43±2.70）%。5.扶正调气方及其联合化疗均可以提高结肠癌细胞系凋亡率,联合化疗作用更为明显。采用最佳作用浓度含药血清、干预最佳作用时间时,扶正调气方联合5FU组对SW480凋亡率为（28.95±1.29）%,明显高于5FU组（21.26±2.26）%和扶正调气方组（17.65±1.02）%,且差异具有统计学意义（p＜0.05）;对 HCT116 凋亡率为（53.35±1.88）%,明显高于 5FU 组（43.33±4.74）%、扶正调气方组（42.51±2.42）%,且差异具有统计学意义（p＜0.05）;对HT29凋亡率为（38.66±1.28）%,明显高于5FU组（29.73±0.86）%、扶正调气方组（23.62±1.23）%,且差异具有统计学意义（p＜0.05）;对CT26凋亡率为（36.49±2.93）%,明显高于 5FU 组（27.91±3.07）%、扶正调气方组（24.47±1.78）%,且差异具有统计学意义（p＜0.05）。6.扶正调气方联合化疗诱导结肠癌细胞系凋亡与调控PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。扶正调气方联合化疗诱导SW480凋亡可能是通过下调mTOR、p-mTOR、p-AKT、PI3K的蛋白表达量来实现的,同时也改变了 ULK1、p-ULK1的表达;扶正调气方联合化疗诱导HT29凋亡可能是通过下调p-mTOR、p-AKT的蛋白表达量来实现的,同时也改变了 ULK1、LC3的表达;扶正调气方联合化疗诱导HCT116凋亡可能是通过下调p-mTOR、p-AKT的蛋白表达量来实现的,同时也改变了 ULK1的表达;扶正调气方联合化疗诱导肠癌细胞CT26凋亡可能是通过下调p-mTOR、p-AKT的蛋白表达量来实现的,同时也改变了 LC3、p-ULK1的表达。7.扶正调气方联合化疗对可抑制CT26荷瘤小鼠瘤体的增长,抑制率（42.74%）优于单纯化疗组（24.36%）,具有统计学差异（p＜0.05）;联合组的小鼠生存质量优于单纯化疗组。研究结论1.扶正调气方可抑制结肠癌细胞系增殖、侵袭和迁移;2.扶正调气方可以诱导结肠癌细胞系凋亡,联合化疗可提升其效果;3.扶正调气方联合化疗诱导结肠癌细胞系凋亡可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路来实现的;4.体内实验进一步证实扶正调气方联合化疗可以提高抑瘤效果。