小麦近缘种——粗山羊草（Aegilops tauschii，2n=2x=14，D^tD^t）是普通小麦D基因组供体，存在广泛的高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）等位变异，是小麦品质改良的重要基因资源。分离克隆这些基因不仅可以为小麦的品质育种提供具有自主知识产权的基因资源、拓展遗传基础，而且有望为研究六倍体小麦的起源和进化提供有用的信息和证据。本研究从粗山羊草中分离鉴定了3个新的HMW-GS基因，并进行了异源表达、系统进化分析、翻译后修饰鉴定以及植物双元表达载体构建和烟草转化，主要结果如下：1．粗山羊草HMW谷蛋白新亚基基因的分离与原核表达以粗山羊草TD81和TD130为材料，通过SDS-PAGE、HPCE、RP-HPLC和MALDI-TOF-MS鉴定了两对新的Glu-1D HMW谷蛋白亚基组合，分别命名为1Dx5^*t+1Dy10.1^t和1Dx5.1^*t+1Dy12.1^*t。采用AS-PCR方法，分离克隆了1Dx5^*t、1Dx5.1^*t和1Dy12.1^*t亚基的编码基因，分别为2487bp、2532bp和1947bp，编码827、842和648个氨基酸。DNA序列及推导氨基酸序列具有典型的HMW-GS的序列结构特征，而且1Dx5^*t亚基重复单元更接近一致序列，相对变异率较低，主要体现在每一重复单元的平均变异数和重复单元发生变异的频率上。1Dx5^*t和1Dx5.1^*t推导蛋白分子量与质谱测定分子量非常一致，而1Dy12.1^*t推导蛋白分子量与质谱测定分子量则相差很大，远远超过误差允许范围。设计2对不含信号肽编码区的引物，分别特异扩增基因1Dx5^*t、1Dx5.1^*t和1Dy12.1^*t，然后与原核表达载体pET30a相连，三个基因在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中均得到了高效表达。SDS-PAGE分析表明，基因1Dx5^*t和1Dx5.1^*t表达蛋白与种子中相应的谷蛋白亚基迁移率相同，确证所克隆基因确实为所鉴定新亚基的编码基因。但同时发现几个含有1Dx5^*t的重组质粒表达出一个迁移率超前的小蛋白，而且N-端测序表明大肠杆菌中表达蛋白与相应种子蛋白氨基酸序列相同。这几个重组质粒的测序结果显示，在大肠杆菌中1Dx5^*t基因内发生了180bp的缺失和一个提前终止密码子的突变，由变异了的基因序列推导的蛋白分子量与表达的小蛋白在SDS-PAGE上的迁移率也非常相符。这一结果首次提供了谷蛋白亚基编码基因重组克隆发生变异的直接证据，变异发生的分子机制可能是由于链内不合理重组（illegitimate recombination）的发生，这种机制很可能对谷蛋白亚基基因新的等位变异的产生发挥重要作用。而1Dy12.1^*t基因序列原核表达结果则显示表达蛋白较种子内相应亚基SDS-PAGE迁移率稍快。2．Glu-1D谷蛋白亚基编码基因系统进化分析分别采用Network分析、neighbor-joining tree和同源树构建对Glu-1D-1和Glu-1D-2位点等位变异间的系统进化关系进行分析，结果表明1Dx5^*t，1Dx2^t，1Dx1.6^t真和1Dx2.2^*均处于源节点，代表比较原始的基因序列，这暗示六倍体小麦至少起源于4个独立的杂交事件。Network、neighbor-joining tree和同源树分析结果相互吻合，表明普通六倍体小麦D基因组是多起源的。结合多起源假说与不合理重组的分子机制，提出了Glu-1D-1位点等位变异可能的产生途径：9个已克隆的Dx亚基基因由1Dx5^*t，1Dx2^t，1Dx1.6^t和1Dx2.2^*分化而来。特别地，1Dx2.2^*基因可能早先就存在于粗山羊草中（也可能由粗山羊草中一个更原始的基因衍生而来），在某一时期通过某种罕见的远交或异型杂交转移到普通小麦中。由于1Dx2.2^*基因内561bp的长正向重复序列可能发生不合理重组，产生了类似1Dx2基因，该基因在小麦进化过程中通过点突变、非均等交换等事件，进而产生了1Dx2.2基因。3．谷蛋白亚基1Dy12.1^*t翻译后修饰分析鉴于1Dy12.1^*t亚基质谱测定分子量与基因推导蛋白分子量的巨大差异和SDS-PAGE的反常电泳现象，采用液质联用技术对其进行了蛋白翻译后修饰的鉴定。理论上1Dy12.1^*t亚基含有13个精氨酸和7个赖氨酸，且精氨酸和赖氨酸均不与脯氨酸相连，经Trypsin充分酶解后，应该产生21个不同的肽段，实际鉴定唯一肽段数是12个，蛋白鉴定覆盖率最高19.8％。虽然离国际认可的蛋白覆盖率还有一定差距，但从1Dy12.1^*t亚基翻译后修饰位点预测结果看，很多可能性高的修饰位点所在的肽段可能还没有得到很好的鉴定，所以仍不能排除该亚基存在某种程度的翻译后修饰（如糖基化和磷酸化等）的可能。而且我们发现另一材料TD87中较1Dy12.1^*t亚基SDS-PAGE迁移率稍快、MALDI-TOF-MS测定分子量相差很大的1Dy亚基，其编码基因序列却与1Dy12.1^*t完全相同；又考虑该基因序列原核细胞表达蛋白较种子蛋白1Dy12.1^*t亚基迁移率稍快、烟草种子胚乳表达蛋白与1Dy12.1^*t亚基迁移率一致、免疫反应性相同的事实，我们认为TD130中1Dy12.1^*t亚基存在翻译后修饰的可能性较大，进一步的鉴定还在进行中。4．谷蛋白基因植物双元表达载体的构建及其烟草转化针对克隆基因DNA序列特点，构建了两种植物双元表达载体pBI121PVP1-Glu和pBINHP-GluT，经一系列中间载体和最终载体的酶切鉴定，证明表达载体的构建完全正确。载体pBINHP-GluT的构建，精心选择经试验验证了其驱动活性的胚乳特异性启动子，选择添加HMW谷蛋白亚基基因和大部分LMW谷蛋白亚基因内部均不含有的XbaⅠ和KpnⅠ内切酶位点，并将目的谷蛋白亚基编码基因的调控置于T-DNA区内，从而使这一载体在植物遗传转化中具有很大的优势。根癌农杆菌介导烟草叶盘转化结果表明，1Dy12.1^*t基因在烟草种子胚乳中得到成功表达，表达蛋白与TD130相应亚基具有相同的SDS-PAGE迁移率，且HMW-GS多克隆抗体Westhern blotting检测为阳性，不仅证明所克隆1Dy12.1^*t亚基编码基因的正确性，而且验证了所构建载体的有效性，为下一步小麦的遗传转化奠定了基础。