研究背景和目的:多靶点、多激酶抑制剂索拉非尼是第一个被FDA批准用于晚期肝癌患者治疗的靶向药物,但是索拉非尼耐药是导致晚期肝癌患者预后不良的主要原因。自噬(autophagy)是不同于凋亡的一种细胞死亡编程,大量的研究证实细胞自噬的发生与肿瘤的药物敏感性密切相关。最近大量的研究证实蛋白质翻译后修饰是调节蛋白质生物学功能的关键步骤,是蛋白质动态平衡和相互作用的重要分子基础,几乎参与了细胞所有的生理活动过程。类泛素蛋白FAT10(Human HLA-F adjacent transcript 10)目前认为是蛋白质翻译后修饰过程中最重要的蛋白之一。研究表明FAT10在多种恶性肿瘤的的发生发展中起关键的作用,我们前期大量的研究证实FAT10在肝癌组织中呈现高表达,降低FAT10的表达可以显著抑制肝癌的增殖和侵袭转移,然而FAT10和自噬在肝癌索拉非尼耐药中的关系以及FAT10与自噬的关系尚不清楚。本研究拟先通过构建索拉非尼耐药的肝癌细胞株观察FAT10对索拉非尼耐药的关系;其次通过体内和体外实验明确FAT10是否调控自噬进而影响肝癌的索拉非尼耐药;最后探索FAT10调控自噬的具体分子生物学机制。方法:1、首先构建索拉非尼的耐药的肝癌细胞株,观察索拉非尼耐药细胞中FAT10表达情况;进一步我们将shFAT10干扰质粒稳定转染到索拉非尼耐药的肝癌细胞中,荧光定量PCR和Western blot检测索拉非尼耐药的肝癌细胞中FAT10蛋白表达变化;利用流式细胞分析及Western blot等方法观察降低FAT10表达后肝癌细胞对索拉非尼敏感性的变化;通过裸鼠荷瘤模型和免疫组化观察降低索拉非尼耐药的肝癌细胞株中FAT10的表达对索拉非尼敏感性的影响。2、通过Western blot、免疫荧光和电镜等实验观察在索拉非尼耐药的肝癌细胞中自噬水平的变化以及改变FAT10表达后索拉非尼耐药细胞株自噬水平的变化,同时通过免疫组化观察裸鼠荷瘤模型中瘤体组织中自噬水平的变化。3、通过芯片技术检测在索拉非尼耐药的肝癌细胞中降低FAT10表达后与自噬相关的PTEN/AKT信号通路的表达变化,然后进一步采用Western blot实验明确PTEN/AKT信号通路中关键蛋白的变化;最后通过Western blot和细胞免疫荧光实验检测在索拉非尼耐药的肝癌细胞下调FAT10表达后索拉非尼耐药细胞株中PTEN/AKT信号通路中关键蛋白和自噬水平的变化。4、通过免疫共沉淀、体外泛素化实验、免疫荧光等实验探索FAT10调控PTEN/AKT信号通路的具体的分子生物学机制。结果:1、通过在体外构建了索拉非尼耐药的肝癌细胞,发现在索拉非尼耐药的肝癌细胞株中,FAT10的mRNA和蛋白表达水平显著增加。下调索拉非尼耐药的肝癌细胞株中FAT10表达后,流式细胞分析结果显示耐药细胞株的凋亡水平显著的增加,且Western blot结果发现耐药细胞株中的凋亡相关蛋白显著增加。进一步通过构建裸鼠皮下荷瘤模型也发现降低shFAT10+索拉非尼组瘤体体积和重量显著下降,而且Tunel结果也证实shFAT10+索拉非尼组的瘤体组织凋亡显著增加。2、通过免疫荧光和电镜发现索拉非尼耐药肝癌细胞经索拉非尼处理后,细胞自噬水平显著的增加。然后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后经索拉非尼处理,通过免疫荧光和电镜发现耐药细胞自噬水平显著下降;Western blot结果发现凋亡及自噬相关蛋白表达下降;同时体内实验同样证实下调FAT10的表达后经索拉非尼处理,耐药肝癌细胞自噬水平增加。最后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10表达的同时加入雷帕霉素进行处理,Western blot实验发现加入雷帕霉素凋亡可以阻断由FAT10表达下调所导致的自噬及凋亡相关蛋白表达的增加,免疫荧光结果同样显示细胞内自噬水平较雷帕霉素处理前下降。3、采用Western blot实验检测索拉菲尼耐药肝癌细胞株经索拉非尼处理后PTEN/AKT信号通路中关键蛋白的表达变化,发现耐药细胞中PTEN蛋白表达下降,p-AKT表达增加,总的AKT蛋白没有变化,提示PTEN/AKT信号通路调控自噬参与了索拉非尼的耐药。然后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后经索拉非尼处理,Western blot实验结果显示PTEN蛋白表达下降,p-AKT、凋亡相关蛋白表达增加,总的AKT表达没变化。最后在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达,加入AKT信号激活剂SC79以及在下调FAT10表达的同时加入SC79,Western blot实验结果发现加入AKT信号激活剂SC79后耐药细胞自噬和凋亡相关蛋白表达显著减少,p-AKT表达增加;在下调FAT10表达的同时加入SC79可以阻断由FAT10表达下调所导致的自噬水平的下降和凋亡相关相关蛋白的增加,免疫荧光结果同样显示细胞内自噬水平较SC79处理前增加。4、通过免疫共沉淀结果发现在索拉非尼耐药肝癌细胞中FAT10蛋白与PTEN蛋白不结合,但是FAT10蛋白与PTEN蛋白的E3泛素连接酶NEDD4存在相互结合。在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后,Western blot实验结果发现NEDD4蛋白表达下降,PTEN蛋白表达增加,p-AKT和自噬及凋亡相关蛋白表达下降,总的AKT表达没变化。在索拉非尼耐药肝癌细胞中转染His-NEDD4质粒后检测相关蛋白表达变化,发现NEDD4蛋白表达增加,PTEN表达下降,p-AKT表达增加,总的AKT表达没变化,自噬及凋亡相关蛋白表达下降,且细胞免疫荧光实验发现细胞内自噬水平降低。在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10表达的同时转染His-NEDD4质粒后检测相关蛋白表达变化,结果发现NEDD4蛋白表达下降,PTEN表达增加,p-AKT表达下降,转染NEDD4可以阻断由FAT10表达下调所导致的自噬及凋亡相关相关蛋白的增加且细胞免疫荧光实验也发现细胞内自噬水平较shFAT10组降低。5、通过蛋白质降解速率实验发现在索拉非尼耐药肝癌细胞中下调FAT10的表达后可促进NEDD4蛋白酶体降解,且抑制PTEN蛋白酶体降解。最后通过泛素化实验证实FAT10通过抑制NEDD4的泛素化水平从而稳定NEDD4蛋白表达。结论:FAT10通过稳定NEDD4蛋白进而调控PTEN/AKT信号通路诱发自噬,最终导致肝癌细胞对索拉非尼耐药。