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背景酒精是一种常见的成瘾物质,慢性酒精暴露会导致大脑功能的适应性改变,一旦突然减少饮酒量或停饮会出现特有的戒断反应,如易激惹、攻击性强、食欲减退,甚至出现癫痫发作等,其发病机制尚未明确。有研究表明表观遗传学修饰参与了酒依赖的病理过程。既往研究提示NMDA受体尤其是NR2B亚基与酒精戒断综合征的关系密切,但对NR2B基因表达的表观修饰调控研究结果不一。本研究将从组蛋白乙酰化方面探讨NR2B的表达情况及其与酒精戒断综合征的关系。目的1.建立慢性酒精暴露的动物模型,观察慢性酒精暴露后不同戒断时间点大鼠的行为学变化。2.检测慢性酒精暴露后不同戒断时间点大鼠海马NR2B蛋白、NR2Bm RNA表达水平及NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平。3.探讨表观修饰对酒精戒断综合征的影响。方法1.雄性Wistar大鼠72只,随机分为6组,分别为:戒断2h组、戒断6h组、戒断12h组、戒断1d组、戒断3d组和正常对照组,每组12只。5个戒断组大鼠自由饮用6%(v/v)的酒精水溶液16周,正常对照组大鼠饮用纯净水16周。2.戒断组分别于末次饮酒后2h、6h、12h、1d、3d时,正常对照组于末次饮水后2h时,评估戒断综合征后处死大鼠取脑组织制备实验样品。3.采用免疫荧光和免疫蛋白印迹(western blot)法检测各组大鼠海马NR2B蛋白表达水平。4.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测各组大鼠海马NR2Bm RNA表达水平。5.采用染色质共沉淀(CHIP)法检测各组大鼠海马NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平。结果1.行为学结果:本实验记录饮酒组大鼠平均每天饮用6%(v/v)酒精水溶液155.93ml/kg体重,相当于摄入纯酒精7.39g/kg体重,整个实验过程中每天的饮酒量变化不大。实验前对照组大鼠体重(264.00±15.20)g与饮酒组大鼠体重(264.40±13.15)g相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。至实验结束时,对照组大鼠体重(454.71±14.16)g与饮酒组大鼠体重(447.69±56.38)g相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。大鼠在饮酒期间较为温顺,不易激惹,攻击性行为较少;酒精撤除后,大鼠出现打喷嚏、理毛、咀嚼、易激惹、尾巴强直、低头拱背、听源性癫痫发作强度增加。在戒断2h(10.42±2.50)、6h(15.42±1.93)、12h(9.25±2.01)、1d(7.67±1.92)组,其戒断综合征评分均显著高于正常对照组(1.50±0.80)(P﹤0.05),以戒断6h组评分最高,随后逐渐减小,戒断3d(2.25±0.87)时戒断综合征评分与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。2.免疫荧光结果:戒断2h、6h、12h、1d组大鼠海马NR2B平均荧光强度分别为(1411.36±210.72)、(987.38±104.32)、(823.62±48.14)和(554.71±73.13),与正常对照组(378.56±67.65)相比明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05),戒断3d组(437.24±123.76)表达也有增多,但与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。3.Western blot结果:戒断2h、6h、12h、1d组海马NR2B蛋白表达水平分别为(2.201±0.375)、(1.535±0.137)、(1.117±0.149)和(0.677±0.054),与正常对照组(0.481±0.085)相比明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05),戒断3d组(0.530±0.113)表达水平也有增高,但与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。4.实时荧光定量PCR结果:戒断2h、6h、12h、1d组海马NR2Bm RNA表达水平分别为(0.330±0.046)、(0.242±0.059)、(0.202±0.044)和(0.179±0.039),与正常对照组(0.130±0.022)相比明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05),戒断3d组(0.154±0.022)转录水平也有增高,但与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。5.染色质共沉淀结果:戒断2h、6h、12h、1d组海马NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平分别为(22.258±2.951)、(17.200±0.890)、(15.028±1.348)和(13.572±1.778),与正常对照组(8.949±1.211)相比明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05),戒断3d组H3K9乙酰化水平(9.458±1.402)也有增高,但与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。6.相关性分析结果:戒断综合征评分与大鼠海马NR2B蛋白表达水平呈正相关(r=0.522,P﹤0.01);大鼠海马NR2B蛋白表达水平与NR2Bm RNA表达水平呈正相关(r=0.746,P﹤0.01);大鼠海马NR2Bm RNA表达水平与NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平呈正相关(r=0.659,P﹤0.01);大鼠海马NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平与戒断综合征评分呈正相关(r=0.479,P﹤0.01)。结论1.慢性酒精暴露戒断后大鼠海马NR2B蛋白、NR2Bm RNA表达水平、NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平均上调。2.NR2B基因启动子区组蛋白H3K9乙酰化调控NR2B基因转录水平进而影响NR2B蛋白表达的改变很可能是酒精戒断综合征的重要机制之一。背景纹状体作为奖赏通路的重要组成部分,在酒依赖相关行为表征改变方面有极其重要的作用,已成为慢性酒精暴露研究的重要脑区。NMDA受体是酒精在中枢神经系统的重要作用靶点,其受体亚基NR2B与酒精戒断综合征关系密切。本研究拟分析慢性酒精暴露后大鼠纹状体不同戒断时间点NR2B表达的改变与戒断综合征的相关性,探讨酒精戒断综合征的相关机制。目的1.建立慢性酒精暴露动物模型,观察不同戒断时间点大鼠的行为变化。2.检测不同戒断时间点大鼠纹状体NR2B蛋白及NR2Bm RNA的表达变化。3.探讨酒精戒断综合征的相关机制。方法1.雄性Wistar大鼠72只,随机分为6组,分别为:戒断2h组、戒断6h组、戒断12h组、戒断1d组、戒断3d组和正常对照组,每组12只。5个戒断组大鼠自由饮用6%(v/v)的酒精水溶液16周,正常对照组大鼠饮用纯净水16周。2.戒断组分别于末次饮酒后2h、6h、12h、1d、3d时,正常对照组于末次饮水后2h时,评估戒断综合征后处死大鼠取脑组织制备实验样品。3.采用免疫荧光法和western blot检测各组大鼠纹状体NR2B蛋白表达水平。4.采用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠纹状体NR2Bm RNA表达水平。结果1.行为学结果:同第一部分。2.免疫荧光结果:戒断2h、6h、12h、1d组大鼠纹状体NR2B平均荧光强度分别为(2710.56±194.21)、(5035.16±234.41)、(3326.23±378.16)、(2570.64±177.88),与正常对照组(2210.00±178.20)相比明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05),戒断3d组(2021.10±184.43)与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。3.Western blot结果:戒断2h、6h、12h、1d组大鼠纹状体NR2B蛋白表达水平分别为(0.186±0.012)、(1.444±0.134)、(0.771±0.085)、(0.173±0.013),与正常对照组(0.151±0.010)相比明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05),戒断3d组(0.148±0.011)与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。4.实时荧光定量PCR结果:戒断2h、6h、12h、1d组大鼠纹状体NR2Bm RNA表达水平分别为(0.028±0.003)、(0.316±0.049)、(0.238±0.033)、(0.022±0.004),与正常对照组(0.007±0.001)相比明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05),戒断3d组(0.012±0.004)与正常对照组相比差异无统计学意义(P﹥0.05)。5.相关性分析结果:戒断综合征评分与NR2B蛋白表达水平呈正相关(r=0.683,P﹤0.01);NR2B蛋白表达水平与NR2Bm RNA表达水平呈正相关(r=0.929,P﹤0.01);NR2Bm RNA表达水平与戒断综合征评分(r=0.645,P﹤0.01)呈正相关。结论1.慢性酒精暴露后不同戒断时间点大鼠纹状体NR2B蛋白表达及基因转录水平均上调;2.大鼠纹状体NR2B基因转录水平的改变进而引起NR2B蛋白表达水平的改变可能是酒精戒断综合征的重要调控机制之一。