前言:近年来肺癌的发病率及死亡率已位列各种恶性肿瘤之首，80％左右的死因为侵袭和转移。因此揭示肺癌侵袭与转移的分子机制，寻找新的肺癌生物学行为的标记物，不仅对肺癌的预后评估大有益处，而且也能为开发出有效的靶向治疗药物提供实验基础，具有重要的理论及现实意义。　　WWCs(WW and C2 domain containing)蛋白家族被认为是Hippo通路的上游激活因子，人类WWCs蛋白家族(WWC1，WWC2，WWC3)分子虽然来源于不同的染色体，但在分子结构上有高度的保守性。目前，有关WWCs家族在人类肿瘤中的作用报道较少，且仅限于对WWCl的研究上。有报道指出在人胚肾细胞中WWC1单独或与其他分子(NF2，Willin，PTPN)共同激活Lats1激酶作用，也有报道指出在乳腺癌细胞中WWC1不依赖于MST激酶引起Lats1磷酸化水平增加，激活Hippo通路，同时抑制乳腺癌细胞上皮间质转化，减弱癌细胞增殖能力，认为WWC1为抑癌因子。然而，日本学者Yohei Yoshihama等在胃癌的研究中却发现WWC1为高表达和aPKC的低表达，并与淋巴结转移和不良预后呈正相关。这些结果说明了WWCs蛋白家族在人类肿瘤中的作用是复杂的，许多深入的作用机制尚待被揭示。而WWC2和WWC3与人类肿瘤的关系未见报道。　　在本文中，我们探究WWCs蛋白家族在非小细胞肺癌中表达与临床病理因素的关系，以及WWCs与上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin有无关联。为寻找非小细胞肺癌的生物标记物提供实验基础。　　材料和方法:　　1、组织来源　　159例非小细胞肺癌标本均来自中国医科大学附属第一临床医院病理科存档蜡块。术前均未接受化疗或放射治疗。其中男性为92例，女性为67例，平均年龄是60岁。根据WHO2015肺癌组织学分类标准:腺癌93例，鳞癌66例。根据2009年国际抗癌联盟TNM分期标准，Ⅰ期87例，Ⅱ-Ⅲ期72例。有淋巴结转移73例，无淋巴结转移86例。以40例正常肺组织作对照。　　2、免疫组织化学染色　　所有的组织均经中性甲醛固定，石蜡包埋后，制成4微米厚度的切片。采用S-P免疫组化法进行染色。一抗使用多克隆兔源性的WWC1抗体(1∶400，Sigma)，WWC2抗体(1∶400，Sigma)，WWC3抗体(1∶400，Sigma)，E-cadherin抗体(1∶100，中杉金桥），N-cadherin抗体(1∶100，中杉金桥)4度孵育过夜。以PBS代替一抗作为空白对照。生物素标记的二抗(Ultrasensitive; MaiXin，Fuzhou，China)37℃孵育30分钟，DAB显色。两名病理诊断医师分别对组织切片染色情况进行评分。结果判定:0分（无着色），1分(1-25％)，2分(26-50％)，3分(51-75％)，4分（76％以上）。再根据细胞着色的强度，各指标蛋白的表达又被划分成3个等级:0分（无着色），1分（浅黄色颗粒），2分（深黄色或者黄褐色颗粒）。每一张组织切片都对应一个百分比分数和着色分数，将二者相乘，所得的乘积即为该切片的最终得分。将小于或者等于4分的定义为阴性表达，而大于4分者定义为阳性表达。　　3、Western Blot　　采用RIPA裂解液对组织或细胞进行充分裂解，然后分别提取其总蛋白，取60微克的总蛋白通过6％、8％、10％浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳，然后转印到PVDF膜上。5％脱脂奶粉封闭1小时，一抗WWC3(1∶500)，GAPDH(1∶10000)(Sigma，St.Louis, MO, USA), snail(1∶1000, Cell Signaling Technology Danvers, MA, USA),E-cadherin, N-cadherin(1∶1000, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA),4℃过夜。山羊抗兔鼠二抗(1∶2500，Cell Signaling Technology Danvers，MA，USA)37℃孵育1小时。ECL发光后，ImageJ进行条带灰度值测定，以与GAPDH的比值作为相对表达量。实验重复三次取均值。　　4、集落形成实验　　在A549和H1299中转染WWC3质粒或干扰序列48h后，将细胞接种到6厘米细胞培养皿（A549，H12991000个/皿）孵育12天。用PBS洗涤，并用吉姆萨染色。有超过50个细胞的集落数进行计数。　　5、细胞基质胶侵袭实验　　在24孔板中以双无的1640培养基按照1∶3的比例稀释基质胶(BD Biosciences)，铺8微米孔径的上室(Costar)。然后将转染48小时后的A549、H1299、以100微升含有5×105个的细胞密度接种在上室并孵育16小时。下室放含有10％小牛血清的培养基。种植后培养48小时后，冰甲醇固定15分钟，苏木素染色。随机选取10个视野，计数侵袭到小室下的细胞数。实验重复三次，取平均值。　　6、数据分析　　采用SPSS17.0统计分析软件，结果采用X2检验进行数据分析，P＜0.05为差异有意义。　　结果:1、非小细胞肺癌中WWCs，E-cadherin，N-cadherin的表达模式　　我们通过免疫组织化学的方法检测了159例肺癌组织标本和40例正常肺组织中WWCs的表达情况。结果发现在肺癌和正常肺组织中，WWC1，WWC2，WWC3均定位于细胞浆中，但是，WWC3在肺癌细胞中的表达减少(89/159，56％)，其阳性率明显低于正常肺组织(44％ vs.77.5％，p＜0.001)，而在肺癌组织中WWC1、WWC2的阳性率与癌旁正常组织相比，并没有明显的差别(分别为WWC1:54％ vs.35％, p=0.151; WWC2:55.3％ vs.52.5％, p=0.859)。　　2、WWC3的低表达与肺癌的不良预后相关　　进一步地，我们对WWC3的表达和肺癌的临床病理因素的关系进行了统计学分析，结果提示WWC3的低表达与肺癌低分化(p=0.010)、高TNM分期(p=0.016)、淋巴结转移(p=0.002)呈正相关，但与年龄，性别，组织学类型无明显关系。　　3、非小细胞肺癌中WWC3的低表达与E-cadherin和N-cadherin相关　　在连续病理切片对比分析WWC3与E-cadherin和N-cadherin表达的关系。我们发现WWC3的低表达与E-cadherin的低表达正相关，而与N-cadherin的高表达呈现明显的正相关。　　4、WWC3能够抑制肺癌细胞的增殖和迁移　　我们在低表达WWC3的H1299中转染WWC3质粒，在高表达WWC3的A549细胞中使用siRNA干扰WWC3的表达，集落形成实验结果提示:WWC3能够抑制肺癌细胞克隆形成能力（转染质粒组vs.对照组，422 vs.189，p＜0.05）。而Transwell结果发现在H1299细胞中转染WWC3，能够抑制肺癌细胞的迁移能力（转染质粒组vs.对照组，266 vs.86，p＜0.05）;反之，在A549中敲除WWC3与转染WWC3的作用相反（集落:敲除组vs.对照组，，188 vs.432; Transwell;敲除组vs.对照组，124 vs.256，p＜0.05）。　　5、WWC3影响上皮间质转化相关蛋白的表达　　为了进一步探究WWC3对肺癌细胞侵袭转移能力的影响，我们双向调控WWC3后，检测了对侵袭转移密切相关的上皮间质转化(EMT)蛋白表达的影响，Western Blot结果发现过表达WWC3能够上调E-cadherin，下调N-cadherin及Snail表达水平;沉默WWC3能够下调E-cadherin，上调N-cadherin及Snail水平。　　讨论: WWCs蛋白家族中WWC1（也称为KIBRA），能够调节细胞内运输转运过程和细胞极性，在果蝇中，WWC1被示视作抑癌基因，通过调节Hippo信号通路，能控制组织生长和器官大小，有关前期文献报道WWC1激活Hippo通路，认为WWC1为抑癌因子，但关于WWC2和WWC3的在人类组织尤其是恶性肿瘤组织中的表达和亚细胞定位情况及其所发挥的生物学作用和相关机制并无报道。在本文中，我们发现WWC1、WWC2、WWC3均表达于肺癌细胞浆，且WWC3在肺癌组织的表达低于癌旁正常肺组织，WWC1、WWC2并没有明显趋势。　　前期文献报道WWC1抑制乳腺癌细胞上皮间质转化，减弱癌细胞增殖能力，而抑制WWC1的表达能减少细胞增殖，并增加癌组织侵袭性;然而，在另有学者的报道WWC1在胃癌细胞中高表达、aPKC低表达和胃癌不良预后相关。这些结果说明了WWCs蛋白家族在人类肿瘤中的作用是复杂的，许多深入的作用机制尚待被揭示。而我们在肺癌细胞中发现WWC1的表达与正常肺组织相比，并没有明显的趋势，这可能与蛋白的表达具有细胞或组织的特异性相关，也可能在肺癌的发生发展中WWC1并未发挥重要的作用，具体机制需要进一步研究。而结构高度保守的WWC2、WWC3在肿瘤中尚无研究，Real-time PCR发现WWC3在肺组织中高表达，我们的结果也验证了这一点，而WWC3在肺癌的表达低于肺组织，说明WWC3在肺癌的发生可能起到抑制的作用，而WWC3的低表达的原因则需要进一步的实验来阐明。　　我们利用统计学方法统计WWC3的表达与肺癌临床病理因素之间的联系，发现WWC3的低表达与肺癌的低分化(p=0.010)，高TNM分期(p=0.016)，淋巴结转移正相关(p=0.002)，这更加证明WWC3与肺癌密切相关。但是值得注意的是，我们检测的病例仍然是小规模，小样本的检测（159例），需要更大规模的临床病例去验证WWC3的作用。　　上皮间质转化(EMT)在肿瘤的发生发展中起到重要的作用，E-cadherin、N-cadherin为EMT关键分子，E-cadherin的下调，N-cadherin的上调和肺癌侵袭能力的增强密切相关。连续病理切片对比分析WWC3与上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、 N-cadherin的表达关系，统计分析结果显示，在肺癌中WWC3的低表达与E-cadherin的低表达，N-cadherin的高表达正相关。这证明了WWC3在肺癌中可能通过抑制EMT来抑制肿瘤的发生发展。　　双向调控WWC3，在H1299细胞中转染WWC3表达质粒，能够抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力;相应地，在A549细胞中转染WWC3-siRNA能够明显促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力。功能学实验的结果提示我们WWC3能够抑制肺癌侵袭能力，同时在过表达WWC3后，E-cadherin表达增加，Snail和N-cadherin的表达降低，而干扰WWC3后，E-cadherin的表达降低，Snail和N-cadherin的表达升高，提示WWC3可能通过上调E-cadherin下调Snail和N-cadherin促进肺癌细胞的侵袭，但是WWC3如何影响E-cadherin表达，进而发挥抑制肿瘤侵袭转移的作用，这一问题需要进一步地实验来证实。　　综上所述，WWC3在肺癌细胞浆内为低表达，且与非小细胞肺癌低分化、高TNM分期、淋巴结转移相关，并且WWC3与E-cadherin、N-cadherin表达相关。　　结论:1、WWC3在支气管上皮细胞中高表达，而在肺癌组织的细胞浆内呈低表达。2、WWC3的低表达与非小细胞肺癌低分化、高TNM分期、淋巴结转移相关，并且与E-cadherin的高表达和N-cadherin的低表达相关。3、WWC3可能通过下调Snail和N-cadherin，上调E-cadherin的表达发挥抑制肺癌细胞侵袭和转移能力的作用。