论文部分内容阅读
目的:我们前期研究发现CADM1/TSLC1在膀胱尿路上皮癌中表达降低甚至缺失,且与病理分级呈负相关。为进一步探讨CADM1在膀胱尿路上皮癌中表达降低的机制,并探讨CADM1过表达后对膀胱癌细胞系细胞增殖、侵袭、及凋亡的影响,为阐明CADM1基因在膀胱癌发生发展中的功能及其可能机制奠定研究基础。方法:1、甲基化特异性PCR技术(MSP)检测84例膀胱尿路上皮癌中CADM1基因启动子区CpG岛甲基化状态,同时选取20例正常膀胱黏膜组织作为对照;WB检测CADM1蛋白表达情况,分析CADM1基因启动子CpG岛甲基化状态与临床病理参数和蛋白表达量之间的关系。2、构建CADM1过表达和干扰慢病毒载体并稳定转染人膀胱癌T24细胞系,获得Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh RNA-T24,Ad-GFP2-T24(AdGFP1-T24和Ad-GFP2-T24分别为过表达和干扰对应载体转染T24细胞系),RT-PCR和WB验证转染效率;甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理T24细胞系,获得5-Aza-CdR-T24。3、WB检测Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh1-T24,Ad-GFP2-T24,5-Aza-CdR-T24,T24共6种细胞株凋亡相关蛋白(caspase-3,bcl-2,bax)、EMT标记物(E-cadherin,β-catenin,Vimentin)、细胞周期相关蛋白(p27,cyclinD1,cyclinE1,CDK2)的表达情况。4、MTT法测定Ad-CADM1-T24,Ad-GFP1-T24,Ad-sh1-T24,Ad-GFP2-T24,5-Aza-Cd R-T24,T24共6种细胞株细胞增殖能力;Transwell体外侵袭实验检测上述6种细胞株细胞侵袭能力;流式细胞仪检测上述6种细胞株细胞周期变化。结果:1、20例正常膀胱黏膜组织中均未检测到CADM1基因甲基化,84例膀胱尿路上皮癌组织中43例检测到CADM1启动子区甲基化,甲基化率为51.2%(43/84),两组相比差异有统计学意义(P<0.01);膀胱癌组织中CADM1基因启动子区CpG岛甲基化状态与患者的年龄、性别、肿瘤数目无关(P>0.05),而与肿瘤直径、肿瘤是否复发、病理分级和临床分期有关,差异有统计学意义(P<0.05)。膀胱癌组织中cadm1蛋白表达(0.2613±0.1405)较正常组织(0.6957±0.0924)显著下降,差异有统计学意义(p<0.01)。膀胱癌组织中发生cadm1基因启动子cpg岛甲基化其蛋白表达量明显低于膀胱癌组织中未发生cadm1基因启动子cpg岛甲基化其蛋白表达量,差异有统计学意义(p<0.01)。2、成功构建cadm1过表达慢病毒载体phblv-ires-cadm1-zsgreen-pgk-puro、干扰慢病毒载体phblv-u6-shrnacadm1-zsgreen-puro及对应空载体,并分别感染人膀胱癌t24细胞系,rt-pcr和wb结果显示ad-cadm1-t24细胞cadm1mrna和蛋白表达量较ad-gfp1-t24和t24明显上升;ad-shrna1-t24细胞cadm1mrna和蛋白表达量较ad-shrna2/3-t24,ad-gfp2-t24和t24明显下调。成功获得稳定过表达和下调cadm1的t24细胞株。3、wb结果显示,ad-cadm1-t24和5-aza-cdr-t24与ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24及t24相比,凋亡相关蛋白caspase-3,bax表达量升高,bcl-2表达量降低,bcl-2/bax比值降低,促进肿瘤细胞凋亡;细胞周期相关蛋白p27表达量显著上调,cyclind1,cdk2,cycline1表达量显著下调;emt相关蛋白e-cadherin,β-catenin表达量显著上调,vimentin表达量显著下调,上调cadm1表达可抑制膀胱癌t24细胞上皮-间质转化。4、mtt检测结果显示,ad-gfp1-t24,ad-gfp2-t24及t24细胞的增殖能力未出现明显差别,而ad-cadm1-t24和5-aza-cdr-t24细胞的增殖能力明显降低,ad-sh1-t24细胞的增殖能力明显提高,ad-cadm1-t24与ad-gfp1-t24和t24、5-aza-cdr-t24与t24、ad-sh1-t24与ad-gfp2-t24和t24相比差异均有统计学意义(p<0.05)。体外transwell侵袭实验检测结果显示,ad-cadm1-t24,ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24,5-aza-cdr-t24,t24细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数分别为(29.54±7.66),(65.57±10.02),(75.61±12.53),(61.32±15.43),(35.36±8.53)和(59.54±14.58);统计结果显示,ad-cadm1-t24与ad-gfp1-t24和t24、5-aza-cdr-t24与t24、ad-sh1-t24与ad-gfp2-t24和t24相比差异均有统计学意义(p<0.05)。流式细胞仪测定细胞周期结果显示,ad-cadm1-t24,ad-gfp1-t24,ad-sh1-t24,ad-gfp2-t24,5-aza-cdr-t24,t24细胞g0-g1期细胞比例(%)分别为(62.11±1.73),(40.73±1.83),(37.14±3.14),(41.50±2.75),(54.10±7.32),(42.93±5.00);s期细胞比例分别为(17.39±3.12),(35.74±2.41),(43.94±3.17),(34.74±2.87),(23.98±7.39),(34.66±3.64);Ad-CADM1-T24与Ad-GFP1-T24和T24、5-Aza-CdR-T24与T24、Ad-sh1-T24与Ad-GFP2-T24和T24相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1、膀胱尿路上皮癌中,CADM1基因启动子区CpG岛甲基化可能是导致其蛋白表达下调的主要原因之一;CADM1基因启动子区CpG岛甲基化与膀胱癌的发生、发展相关。2、上调CADM1表达可明显降低人膀胱癌T24细胞的增殖、侵袭能力,并可促进肿瘤细胞的凋亡。3、CADM1发挥抑癌作用的机制可能与抑制细胞上皮-间质转化、调控和细胞周期、凋亡、增殖等相关蛋白的表达有关。4、甲基化抑制剂5-Aza-Cd R可逆转CADM1基因启动子区CpG岛甲基化状态,从而诱导其重新表达。