论文部分内容阅读
我国是养鹅大国,养殖业占据世界的主要地位。与鸡、鸭等产业相比,我国养鹅产业是个新兴产业,相比国外也是优势产业。因此不仅要改善规模化的饲养管理更要加大对鹅流行性疾病的防控,将我国养鹅产业打造成为领先世界的产业。研究并制备出可以提高鹅免疫力的生物制剂对我国鹅业的可持续发展具有深远意义。鹅α干扰素是一种体内分泌的细胞因子,具有抗病毒活性、抗肿瘤活性、免疫调节等良好功能,属于广谱的抗病毒制剂。本研究采用RT-PCR方法从鹅血液中扩增出具有较高抗病毒活性的鹅α干扰素全长基因片段（576bp）与成熟肽基因片段（498bp）。使用pMD18-T载体与鹅α干扰素全长基因连接,构建重组载体pMD18-T-GoIFN-α,将其测序并进行生物信息学分析。结果表明本研究扩增出的GoIFN-α基因序列与HQ11583同源性高达99.8%,与哺乳动物同源性较低在41.4～45.8%。将扩增出的鹅α干扰素成熟肽基因与pET32a（+）载体双酶切构建原核表达重组质粒pET32a-mGoIFN-α。将重组质粒转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导表达后得到38KDa的重组蛋白。尿素梯度法纯化蛋白后,SDS-PAGE电泳结果表明表达蛋白纯化为单一的目的条带,并通过Western-blot鉴定,得到与预期一致的结果。选择pFast Bac-HT A载体,将载体与鹅α干扰素全长基因双酶切,构建杆状病毒表达重组转移质粒pFast Bac-HT A-GoIFN-α。将重组转移质粒转化至DH10Bac感受态细胞中构建重组杆状质粒Bacmid-GoIFN-α,将重组杆状质粒转染sf9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。大量扩增重组杆状病毒并将病毒液经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE电泳与Western-blot鉴定,成功获得杆状病毒表达重组蛋白。采用细胞病变抑制法测定两种不同方式获得的重组蛋白抗病毒活性。测定原核表达重组蛋白的浓度为1.2mg/m L,抗VSV活性为1.94×103U/m L,比活性为1.61×103U/mg,抗GPV活性为1.66×103U/m L;测定杆状病毒表达重组蛋白的浓度为2.01mg/m L,抗VSV活性为4.46×103U/m L,比活性为2.21×103U/mg,抗GPV活性为3.8×103U/m L。两种不同表达方式获得的重组蛋白具有良好的抗病毒效果,杆状病毒表达重组蛋白抗病毒活性比原核表达重组蛋白活性高,为进一步研究重组鹅α干扰素在雏鹅体内抗GPV增殖作用奠定基础。将192只1日龄健康雏鹅随机分为8组,每组24只。分别选用1×103U、3×103U、5×103U的pET32a-mGoIFN-α原核表达干扰素和Bacmid-GoIFN-α杆状病毒表达干扰素作为试验组,同时设立只注射GPV的攻毒对照组以及只注射无菌生理盐水的正常对照组。1～6组为攻毒试验组,1日龄时腿部肌肉注射1×103U、3×103U、5×103U的原核表达干扰素和杆状病毒表达干扰素,2日龄时腿部肌肉注射GPV(TCID50=10-4.6/0.1m L)0.8m L;7组为攻毒对照组;8组为注射0.8m L无菌生理盐水的正常对照组。在相同饲养条件下观察21d,记录每组雏鹅生存情况并在攻毒后3d、6d、9d、12d、15d、20d,各组随机抽取5只,采集泄殖腔棉拭子检测雏鹅排毒情况。结果表明不同剂量的原核表达干扰素和杆状病毒表达干扰素均可抑制GPV的增殖,提高雏鹅保护率降低排毒率;3×103U杆状病毒表达干扰素在雏鹅体内抑制GPV作用最强,且同一剂量的杆状病毒表达干扰素抑制GPV增殖作用高于相同剂量的原核表达干扰素。综上所述,本研究利用原核表达系统以及杆状病毒表达系统获得的重组鹅α干扰素表达量高且具有良好的抗病毒活性。为鹅干扰素应用于鹅病毒性疾病的防治以及获得水禽疾病的新型制剂提供一定的技术支持。