刚地弓形虫是一类严格的胞內寄生原虫,呈全世界分布,可感染哺乳动物,鸟类,甚至冷血动物,弓形虫有如此广泛的宿主,除了与它强大的入侵机制有关之外,还和它强大的免疫逃避机制和适应并改变宿主细胞环境的能力有着密切的关系。这也是导致弓形虫病难以防控的主要原因。弓形虫致密颗粒蛋白GRA16、GRA24、TgIST可利用宿主细胞信号通路进入宿主细胞核,调控宿主细胞表达,改变宿主细胞的免疫状态和细胞内环境,以实现免疫逃避和长期寄生。致密颗粒蛋白GRA17和GRA23可在纳虫泡膜上形成微孔,该孔可帮助弓形虫摄取宿主营养,致密颗粒蛋白MAF1、GRA3和GRA5参与弓形虫对宿主细胞线粒体和内质网的招募,帮助弓形虫利用宿主营养。可以说,致密颗粒蛋白对于弓形虫胞內寄生十分重要。GRA1是第一个被发现的致密颗粒蛋白,但关于它的生物学功能我们知之甚少,研究它的生物学功能可以为进一步理解弓形虫胞內寄生的特性提供帮助,为以后的弓形虫研究奠定理论基础。本研究以弓形虫致密颗粒蛋白1(TgGRA1)为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和四环素调控系统(Tet-off)对TATi虫株中的GRA1进行条件性敲除,成功构建中间虫株TATi-Tet O7-GRA1虫株,对其进行ATc处理,发现GRA1的表达不能被关闭,说明Tet-off系统不适用于GRA1的敲除。随后改用Cre/loxP条件性敲除系统对RH△hxgprt虫株中的GRA1进行条件性敲除,成功构建中间虫株RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株,复制实验验证TgGRA1对弓形虫胞內寄生的重要性;同时,利用BioID技术,富集GRA1邻近的蛋白,试图发现更多潜在的致密颗粒蛋白和可能的GRA1互作蛋白。具体实验内容如下:1 GRA1蛋白原核表达和多克隆抗体的制备构建p E-SUMO-GRA1原核表达质粒,该质粒在表达感受态细胞BL21(DE3)中能够顺利表达,且蛋白表达在上清,将纯化好的SUMO-GRA1蛋白进行动物免疫,收集免疫后的动物血清,用ELISA检测抗体效价,结果显示该抗GRA1的多克隆抗体具有较高水平的抗体效价,经Western blot检测该抗体可特异性识别TgGRA1。2TATi-TetO7-GRA1虫株的构建利用Tet-off系统对GRA1基因进行条件性敲除。首先,构建能够识别GRA1基因座的pSAG1::Cas9-U6::sgGRA1的CRISPR质粒和同源替换的模板质粒pUC19-Tet O7-GRA1。然后将扩增出来的同源替换片段5’UTR-DHFR-TetO7-GRA1-3’UTR和pSAG1::Cas9-U6::sgGRA1质粒共转染到TATi虫株的速殖子中,乙胺嘧啶进行药物筛选,再通过有限稀释法进行TATi-TetO7-GRA1单克隆虫株的筛选,单克隆经扩大培养后用PCR进行鉴定,结果显示成功获得TATi-TetO7-GRA1虫株。用ATc处理TATi-TetO7-GRA1虫株,经间接免疫荧光检测,GRA1蛋白的表达并未被关闭,虫株生长也很正常。说明Tet-off系统不适用于GRA1的敲除。3 RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株的构建利用Cre-loxP系统对GRA1基因进行条件性敲除。构建同源替换的模板质粒pUC19-GRA1-YFP,然后将扩增出来的同源替换片段5’UTR-tubulin-loxP-GRA1-loxP-YFP-HXGPRT-3’UTR和pSAG1::Cas9-U6::sgGRA1质粒共转染到RH△hxgprt虫株的速殖子中,用黄嘌呤和霉酚酸进行药物筛选,再通过有限稀释法进行RH△hxgprt-loxP-GRA1单克隆虫株的筛选,单克隆经扩大培养后用PCR和间接免疫荧光进行鉴定,结果显示成功获得RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株。4GRA1敲除株表型研究RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株转染能够表达Cre重组酶的pmin-Cre-YFP质粒,Cre重组酶会识别loxP序列,对RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株中的GRA1基因进行剪切,从而实现GRA1的敲除。将GRA1敲除株与RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株进行胞内复制实验,发现GRA1敲除株和RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株相比,GRA1敲除株的复制能力显著性下降。5 BioID技术富集GRA1的周边蛋白用Biotin标记经过遗传改造的RH△hxgprt-GRA1-BirA*虫株,经过24h作用,通过Western-blot检测到RH△hxgprt-GRA1-BirA*虫株有被生物素标记上的特异蛋白,质谱分析这些特异蛋白。经过分析和对比,得到了17个已知GRA蛋白,同时找到了39个未知蛋白和16个已知蛋白。经定位实验鉴定,17个未知蛋白中有2个是致密颗粒蛋白,对16个已知蛋白进行功能分析,推测MYR1和GRA1存在互作的可能性,但它们之间具体的关系还需要进一步实验验证。本研究主要利用Cre-loxP条件性敲除系统和CRISPR/Cas9技术在RH△hxgprt虫株中对GRA1基因进行条件性敲除。GRA1敲除株和RH△hxgprt-loxP-GRA1虫株比较得出:GRA1敲除株的复制能力显著性下降。同时通过BioID技术和LC-MS/MS鉴定出72个GRA1周边的蛋白,并通过定位实验发现了两个新的致密颗粒蛋白。以上结果为弓形虫免疫逃避机制和适应并改变宿主细胞环境机制的研究进一步提供理论基础。