论文部分内容阅读
真核生物广泛存在的转录延伸因子y ELF1(elongation factor 1)是一类进化保守、结构相似的DNA结合蛋白,与减数分裂染色体及基因转录延伸有关。但目前还不清楚y ELF1在基因转录延伸中扮演的角色,也不清楚y ELF1在染色体折叠或解折叠中的作用。PELF1是本课题组以P14-3-3为饵蛋白,通过酵母双杂交,从多头绒泡菌分离出一个由100个氨基酸组成,理论MW为11 KDa、理论p I为5.16的y ELF1类似蛋白。本课题组通过激光扫描共聚焦显微镜观察还发现,PELF1主要聚集在多头绒泡菌核内。为了研究PELF1、y ELF1的功能,通过GST pull-down技术分离得到了与PELF1、y ELF1相互作用的蛋白,并通过LC-MS鉴定分析相互作用蛋白,结果显示,其中大部分为核糖体蛋白,其余蛋白涉及到基因转录,蛋白翻译,糖代谢,信号转导,胁迫应答,磷酸化/去磷酸化调节,细胞结构。为了研究PELF1,本研究通过芯片筛选技术,制备了两株PELF1的单克隆抗体分别命名为m Ab P35、m Ab P59,其中P35与多头绒泡菌PELF1反应,P59与酵母y ELF1反应。使用制备的PELF1单克隆抗体m Ab P35通过western blot检测了多头绒泡菌细胞周期不同时期[第二次同步化有丝分裂开始后1.5 hr(S期)、3.5 hr(G2早期)、5.5 hr(G2中期)、7.5 hr(G2晚期)和9.5 hr(M期)的PELF1蛋白水平的变化,结果发现相对S期的表达量,G2早期PELF1的表达量增加,G2中期下降到与S期基本持平,G2晚期其表达量低于S期,但到了M期,其表达量又上升,略低于G2早期;本实验室前期研究y ELF1的m RNA随多头绒泡菌细胞周期不同时期[第二次同步化有丝分裂开始后1.5 hr(S期)、3.5 hr(G2早期)、5.5 hr(G2中期)、7.5 hr(G2晚期)和9.5 hr(M期)变化结果显示,相对S期m RNA表达量,G2早期(G2期起始后1hr)m RNA表达量下降,G2中期持续下降,再G2晚期期时上升,在M期又下降。蛋白水平变化趋势相比m RNA水平在时间上存在有一定滞后性。本研究通过原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)观察到多头绒泡菌S期、G2期、M期染色质的不同结构。结合免疫胶体金标记与AFM观察到的天然状态下过表达的融合蛋白GST-y ELF1与染色质结合情况,结果显示GST-y ELF1成串珠状紧密排列在染色质DNA上,与实验室前期研究中通过AFM观察到的体外结合实验中PELF1与DNA结合形态一致。结合免疫胶体金标记与AFM观察到天然状态下PELF1与多头绒泡菌第二次同步化有丝分裂开始后1.5hr(S期)、3.5 hr(G2早期)、5.5 hr(G2中期)、7.5 hr(G2晚期)和9.5 hr(M期)染色质结合情况。发现在S期、G2早期和G2中期的多头绒泡菌上均结合有PELF1,而在G2晚期和M期未观察到有PELF1与染色质结合。初步了解了不同细胞周期中PELF1与染色质结合情况,推测PELF1可能与维持染色体DNA的解折叠状态有关。免疫胶体金标记与AFM结合为更好的观察比较复杂的成分中的特定目的蛋白质提供了一个方向。为进一步研究PELF1体内对DNA结构的影响提供了基础。