论文部分内容阅读
合成了噻虫啉半抗原,采用混合酸酐法将噻虫啉半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原;与牛血清蛋白(BSA)偶联制备了免疫抗原用于免疫BALB/c小鼠。将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫过的小鼠脾脏细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞。通过系列筛选和亚克隆,最后得到能稳定分泌抗噻虫啉单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3A5)。将3A5杂交瘤细胞株注射小鼠腹内制得腹水,采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水得到抗体。基于单克隆抗体建立了噻虫啉间接竞争ELISA方法,并对抗原抗体浓度和工作溶液(甲醇含量、离子强度、pH值)进行优化。在最佳优化的条件下(5%甲醇PBS溶液、Na+ 0.14 M、pH 7.4),间接竞争ELISA的IC50值和最低检测限(IC10值)分别为26.3μg/L和1.4μg/L。与噻虫啉结构类似物的交叉反应率都小于0.1%,可以认为没有交叉反应。利用Ph.D.Peptide Display Cloning System构建了随机展示线性八肽库。将33-bp的简并序列连接到M1 3KE载体上,把连接产物电击转化到大肠杆菌感受态细胞制备噬菌体展示线形八肽库,TU为8.7×108 pfu/μg,滴度为1.6×1012pfu/mL。利用生物淘选的方法,从环形8肽噬菌体库及线形8肽噬菌体库中筛选出6种噬菌体展示多肽,并建立了噻虫啉残留噬菌体酶联免疫分析方法。在最优的条件下(5%甲醇PBS溶液、Na+强度0.14M、pH8.5),噬菌体酶联免疫分析方法的IC50值为8.3ug/L,最低检测限IC10值为0.7μg/L,检测范围(IC20-IC80)为1.2-61.1 ug/L。与传统的ELISA法相比,灵敏度提高3倍以上,与其它结构相似的交叉反应率小于0.01%,可以认为没有交叉反应。在土壤、梨、番茄、甘蓝样品中的添加回收率在80.33~116.3%之间,RSD在1.98-9.76%之间,符合农药残留检测的标准。噬菌体ELIS A的检测结果与HPLC的检测结果高度一致,两种检测方法的相关性方程为Y=1.0267x+0.0015,R2=0.9894。研究结果表明从噬菌体展示库中淘选噬菌体展示多肽可以建立敏感的免疫分析的方法,同时建立的分析方法是一种潜在的、有用的检测环境和农产品中噻虫啉的工具。