p53上调凋亡调制物(p53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是一个具有强大促凋亡能力的BH3-only家族蛋白质基因。PUMA通常低表达，但PUMA在许多病理性应激因素可以通过一些转录因子(如p53、p73、E2F1和FOXO3a)上调其表达，借此诱导凋亡的反应。近两年研究发现一个新颖的调控机制:PUMA翻译后调控。转录体PUMA-α编码一个全长为193个氨基酸的蛋白，其中10号位丝氨酸是最重要的磷酸化位点。当10号位丝氨酸被丙氨酸取代可以减慢PUMA的降解、延长其半衰期、增加其稳定性、增强细胞凋亡的能力。　　本课题旨在探讨针对PUMA蛋白10号位磷酸化位点突变的突变型与野生型PUMA蛋白对肿瘤细胞功能方面的差异及其可能的作用机制，为以后寻找更多PUMA蛋白翻译后调控机制梁奠定实验基础。　　目的:　　观察突变型PUMA与野生型PUMA对肿瘤细胞生物学功能方面的差异，并探讨其诱导细胞凋亡的分子机制，此为深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻译后调节奠定实验基础。　　方法:　　通过PCR方法从pCEP4-(HA)2-PUMA质粒中扩增PUMA基因，并克隆到pIRES2-EGFP载体上，构建PUMA真核表达载体pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA，利用定点突变技术构建pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA-T28G质粒，行PCR及测序鉴定;脂质体分别将两种质粒转染Hela细胞，RT-PCR检测PUMA的表达，Western blot检测突变型PUMA蛋白和标签蛋白的表达。　　实验随机分为(1)空载质粒组(2)野生型PUMA组(3)突变型PUMA组，应用脂质体转染的方法分别将空载质粒、野生型PUMA质粒、突变型PUMA质粒转染人宫颈癌细胞中，转染24h及48h后用RT-PCR和Western blot方法检测各组PUMA表达情况;MTT及流式细胞术检测野生型PUMA与突变型PUMA对细胞增殖抑制和促凋亡作用;应用PI及Hoechst33342核染法观察野生型PUMA与突变型PUMA对细胞凋亡的形态学改变;野生型实验组和突变型实验组分别加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮后，Western blot方法检测PUMA蛋白的表达变化情况;RT-PCR方法检测PUMA及凋亡相关基因BAX、BCL-2的mRNA的表达变化;分光光度法检测细胞的Caspase-3活性变化。　　结果:　　经PCR及测序结果表明，正确构建野生型、突变型PUMA重组质粒，PUMA基因第10位氨基酸的第28～30位碱基由TCC突变为GCC，其他碱基均无突变。野生型、突变型PUMA重组质粒转染Hela细胞荧光显微镜观察到绿色荧光表达。Western blot和RT-PCR均检测出目的基因的高表达。提示PUMA基因及其定点突变载体均构建成功。　　在相同转染效率的情况下，通过Western blot分析野生型PUMA组和突变型PUMA组的表达水平，结果表明突变型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一个更高的稳定状态。在表达野生型和突变的PUMA细胞中我们通过实时定量PCR测量出同等量的PUMA mRNA，表明并不是由于转染效率或不同的转录率导致的这种差异;接下来在转染24h后诱导表达野生型和突变型的PUMA细胞中均加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮，然后对PUMA蛋白的降解进行检测，结果表明，由于我们改变了PUMA蛋白的磷酸化位点，导致突变型PUMA蛋白降解延迟、半衰期延长，提示10号位丝氨酸磷酸化在决定PUMA降解率上具有重要的作用;野生型PUMA质粒、突变型PUMA质粒分别转染Hela细胞，在24、48小时后测定光密度值，结果发现细胞转染两种质粒后，细胞存活率随着时间的延长逐渐下降，且转染突变型PUMA质粒在24、48小时的存活率均比野生型PUMA质粒组低，差异有统计学意义(P＜0.05)，这表明突变型PUMA对Hela细胞抑制增殖作用优于野生型PUMA;通过PI及Hoechst33342染色后评价细胞核型，计算被转染细胞中的早期和晚期凋亡细胞数。转染24h后，转染突变型PUMA组在GFP阳性细胞中有22.5％的细胞出现凋亡，空载体组只有11.8％，相比转染野生型PUMA组细胞中增加了约9.2％的细胞凋亡，差异有统计学意义(P＜0.05)。而随着转染PUMA在细胞中表达时间的延长，48h后突变型PUMA组比转染野生型PUMA组细胞凋亡增加了约9.5％，差异有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术结果发现，随着PUMA转染时间的增加，野生型和突变型两组肿瘤细胞的凋亡率均逐渐升高，并且突变型组细胞比野生型组细胞的凋亡率增加更加明显，这与核染色结果相似。　　转染突变型PUMA质粒作用Hela细胞，在0、6、12、24、36、48小时，通过RT-PCR法检测BCL-2和BAX表达。结果发现，随着时间的延长，在PUMA表达逐渐增加的同时，BCL-2表达逐渐减少，而BAX表达无明显变化。PUMA表达在48小时达到最高点，而BCL-2表达在48小时降低到最低点，不同时间点的PUMA和BCL-2表达差异有统计学意义(P＜0.05).提示PUMA转染细胞后降低了BCL-2的活性，而PUMA对细胞内BAX总量没有明显影响(P=0.060)。检测Caspase-3各个时间组活性变化结果表明，在转染突变型PUMA作用后，Caspase-3活性显著升高，转染6h组是0h组的(1.23±0.23)倍，转染12h组是0h组的(2.05±0.17)倍，转染24h组是0h组的(2.75±0.22)倍，转染36h组是0h组的(3.32±0.24)倍，48h达到最高程度，是0h组的(4.21±0.21)倍，各组与0h组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。　　结论:　　1、PUMA具有抑制Hela肿瘤细胞增殖、促进其凋亡的作用，并且突变型比野生型PUMA对Hela肿瘤细胞的抑制作用及促凋亡功能更加明显。　　2、PUMA10号位点的丝氨酸是重要的磷酸化位点，丝氨酸被丙氨酸取代后增加了PUMA稳定性，减慢了其降解、延长了其半衰期。　　3、PUMA对Hela肿瘤细胞的促凋亡作用，是通过调控抗凋亡BCL-2表达，最终导致Caspase-3的活化，引起细胞凋亡。