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背景与目的目前脑卒中的死亡率已经位居全球疾病的第二位,我国第一位。脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是卒中的一种重要类型。急性ICH患者病死率和致残率均较高,且缺乏有效的治疗手段。大多数病例会遗留不同程度的神经功能障碍,常需要长期的康复训练及生活护理,因此给家庭乃至社会都带来了沉重的经济和生活负担。ICH的病理损伤主要包括原发性损伤和继发性损伤。大量研究表明免疫反应在ICH后脑组织的继发性损伤中起重要作用。急性ICH后的系统性免疫反应主要包括免疫激活和随后的免疫抑制。前者主要包括小胶质细胞激活、中性粒细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞等炎症相关细胞的脑内浸润,以及促炎症因子的分泌和释放。后者主要包括卒中诱导的免疫抑制。急性ICH之后,脑抗原通过损伤的血脑屏障释放入血。脑抗原和卒中的严重性及预后紧密相关。ICH之后的免疫抑制能够避免针对脑抗原的过度免疫反应,但免疫抑制也可以降低机体对各种病原体的抵抗力,导致各种感染的发生。感染是卒中后死亡的重要原因之一。ICH后免疫状态的改变和时间依赖性地招募各种炎症细胞,表明大多数的炎症细胞展现有利的和不利的双重作用。中性粒细胞和小胶质细胞的生物学特征和作用已经有大量文献报道,但是特别的淋巴细胞亚群,尤其是T淋巴细胞亚群在ICH之后的适应性免疫反应过程中的作用尚不清楚。CD4+CD25+Fox P3+调节性T细胞(Tregs)通常被认为在维持免疫平衡和抵抗免疫失衡引起的组织损伤过程中起关键作用。最新研究表明,Tregs在调节卒中诱导的免疫损伤和随后的免疫抑制起重要作用,但机制尚不明确。目前关于Tregs的进展主要集中在缺血性卒中,尚缺乏针对ICH患者的相关研究。在现有研究的基础上,本实验主要研究ICH患者外周血Tregs的实时动态改变、神经功能障碍、脑相关抗原和肺炎以及它们之间的相关性,为寻找利用急性ICH患者的Tregs进行免疫治疗提供理论依据。1材料和方法1.1 ICH患者及对照组选择急性ICH患者诊断和治疗根据AHA/ASA的ICH指南进行,患者都经过头部CT或MRI明确出血性病灶。纳入ICH患者70人,同时选取60例过去无卒中病史的健康人员作为对照组,两组的年龄及性别无统计学差异。根据神经功能缺损程度又区分为轻中度患者及重度患者。本研究所有实验方案均经郑州大学第一附属医院和新乡医学院第一附属医院伦理委员会审批同意。1.2标本采集分别于ICH第3天、第7天时清晨空腹采集患者抗凝血。采用EDTA作为抗凝剂。同时送检常规检测。1.3 ICH患者卒中后肺炎发生情况测定于出血后第3天、第7天评定ICH患者卒中后肺炎发生情况,卒中相关肺炎的诊断根据临床表现和体格检查(包括肺部的听诊和叩诊、脓性呼吸道分泌物、发热)、痰培养、胸片或肺部CT的结果确定。1.4流式细胞仪单克隆抗体荧光检测血标本采集后立刻处理进行流式细胞术单克隆荧光抗体表面染色。采用密度梯度离心方法获得单个核细胞经表面染色后,破膜进行胞内染色。应用流式细胞仪FACScalibur及其分析软件获取数据。1.5 ELISA方法检测转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)血浆水平1.6 ELISA方法检测脑相关抗原NSE、S100B及MBP血浆浓度2结果2.1淋巴细胞亚群ICH患者外周血CD3+细胞占淋巴细胞的百分比3天组、7天组为(67.96±7.331,66.19±7.439%),与对照组69.22±7.166%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ICH患者CD3+CD4+细胞占淋巴细胞的百分比,3天组、7天组为(44.32±8.614,42.24±7.653%),与对照组44.52±7.247%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。ICH患者外周血CD3+CD69+细胞占淋巴细胞百分比3天组为、7天组为(4.669±2.842,5.739±2.954%),对照组为2.622±2.159%。ICH3天组与对照组比较,活化的T细胞比例明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);ICH7天组与对照组比较,活化的T细胞比例明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.2外周血TregsICH患者外周血Tregs占CD4+细胞百分比(Treg%),3天组、7天组为(5.569±2.597,6.653±2.924%),对照组为4.199±1.869%。ICH 3天组与对照组比较,外周血Tregs百分比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);ICH 7天组与对照组比较,外周血Tregs百分比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);2.3病情轻重及性别对Tregs的影响ICH 3天组,外周血Treg%病情重的患者为6.301±2.654%,轻中度的患者为4.793±2.329%,两者比较重度组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。在ICH 7天组,外周血Treg%病情重的患者为7.641±2.950%,轻中度的患者为5.634±2.560%,两者比较重度组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。ICH 3天组女性外周血Treg%为5.268±2.648%,与男性结果5.807±2.566%比较,差异无统计学意义(P>0.05);7天组女性外周血Treg%为6.292±2.798%,与男性结果6.944±3.029%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。2.4卒中后肺炎与患者Tregs比例的关系ICH 3天组肺炎患者与无肺炎患者Treg%分别为6.945±2.553%与5.111±2.468%,肺炎患者明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。ICH 7天组肺炎患者与无肺炎患者Treg%分别为7.823±2.771%与6.205±2.884%,肺炎患者明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.5 Tregs相关细胞因子ICH患者外周血TGF-β含量,3天组为22.82±3.11 ng/ml、7天组为26.01±3.05ng/ml,分别与对照组14.18±2.17 ng/ml比较均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);ICH患者外周血IL-10含量,3天组为21.34±2.98 pg/ml、7天组为22.91±3.48 pg/ml,分别与对照组14.15±2.59 pg/ml比较均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.6脑相关抗原含量ICH 3天组NSE血浆含量(23.57±2.897 ng/m L)较对照组(14.33±2.428ng/m L)明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);ICH 7天组血浆NSE含量(22.49±2.956 ng/m L)与对照组相比显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。ICH 3天组S100B血浆含量(377.6±56.74 pg/m L)较对照组(289.9±45.89pg/m L)明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);ICH 7天组血浆S100B血浆含量(319.9±58.16 pg/m L)与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。ICH 3天组MBP血浆含量(6.713±1.232 ng/m L)较对照组(3.401±0.755ng/m L)明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);ICH 7天组血浆MBP含量(7.828±1.394 ng/m L)与对照组相比明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),2.7脑相关抗原与Tregs相关性分析外周血NSE含量与Treg%在ICH 3天组、7天组均无相关性(P>0.05)。外周血S100B含量与Treg%在ICH 3天组、7天组均呈显著正相关(P<0.01);外周血MBP含量与Treg%在ICH 3天组、7天组均无相关性(P>0.05)。2.8病情轻重对ICH患者S100B血浆含量的影响ICH 3天组,病情重的患者血浆S100B含量(398.65±55.26 pg/m L)较轻中度患者(355.21±49.92 pg/m L)明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。ICH7天组,病情重的患者血浆S100B含量(339.424±62.008 pg/m L)较轻中度患者(299.750±46.783 pg/m L)明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.9外周血S100B分别与TGF-β、IL-10的相关性分析在ICH 3天组,外周血S100B与TGF-β含量呈显著正相关(P<0.01);在ICH7天组,外周血S100B与外周血TGF-β含量呈显著正相关(P<0.01)。外周血S100B与IL-10血浆水平在ICH 3天组、7天组均无相关性(P>0.05)3结论3.1 ICH患者急性出血之后促发系统和外周免疫反应,导致激活的外周T细胞增多。3.2 ICH患者外周血Tregs比例明显增多,以及相应的细胞因子TGF-β和IL-10含量增高,提示Tregs参与调节免疫炎症反应。3.3严重神经功能障碍的ICH患者外周血Tregs比例较轻中度患者增高更为显著,提示病情严重程度影响外周血Tregs水平。3.4发生肺炎的ICH患者外周血Tregs比例较未发生肺炎的患者增高更为显著,提示感染影响外周血Tregs水平。3.5 ICH患者脑抗原NSE、S100B和MBP释放增多,提示脑抗原可能促发自身免疫反应。此外,S100B蛋白在严重神经功能障碍患者较轻中度患者增高更加显著。3.6血浆S100B蛋白与Tregs比例呈正相关,但NSE、MBP蛋白与Tregs比例无相关性。3.7 S100B蛋白与TGF-β呈正相关,提示其可能通过调节TGF-β上调Tregs的比例,参与调节卒中后免疫抑制反应过程。