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研究背景和研究目的全氟化合物(PFCs)具有独特的疏水、疏油性和化学稳定性,被广泛地应用于多种工业与民用领域的产品生产中,使其可以通过多种途径进入到环境中。全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)是两种最具代表性的的全氟化合物,作为重要的全氟化表面活性剂,在工业和生活中的广泛应用造成了严重的环境污染,引起了全世界的关注。作为持久性有机环境污染物,PFOS和PFOA具有难降解性、生物蓄积性和生物毒性,近年来在全世界范围内的各类环境介质(水体、土壤、降雪等)、生物体(哺乳类、鱼类、禽类等)和人体(血液、母乳、尿液)内都检测到了该种化合物的存在,其已经对生态系统及人类造成了不同程度的影响。本研究利用秀丽隐杆线虫研究PFOS和PFOA的雄性生殖毒性,寻找评价PFOS和PFOA生殖毒性的敏感指标,探讨PFOS和PFOA对精子发生过程的损伤作用及其毒作用机制。研究方法和结果1、PFOS和PFOA的暴露水平分析利用XAD-2树脂柱富集江苏某水厂原水、出厂水水样,再利用液相色谱串联质谱仪测定原水、出厂水水样中PFOS和PFOA的浓度。其中原水中PFOA的浓度为12.62 ng/L,出厂水中PFOA的浓度为10.18 ng/L,原水和出厂水中未检出PFOS。2、PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫生育力的影响2.1 PFOS和PFOA对L4期N2线虫生育力的影响PFOS和PFOA分别设3个染毒组(0.1、0.01、0.001 mmol/L)和1个空白对照组,应用后代数目和世代时间评价PFOS和PFOA对L4线虫生育力的影响。同步化后L4期幼虫用24孔板染毒24 h,每组挑取10条染毒后的N2线虫,测定其后代数目和世代时间。结果显示L4期幼虫染毒24 h后,与对照组比较,PFOS高、中剂量组后代数目减少具有统计学差异(P<0.05),PFOA的3个剂量组后代数目差异均有统计学意义(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组世代时间差异均无统计学意义(P>0.05)。2.2 PFOS和PFOA对Ll期N2线虫生育力的影响PFOS和PFOA分别设3个染毒组(0.1、0.01、0.001 mmol/L)和1个空白对照组,应用后代数目和世代时间评价PFOS和PFOA对L1期线虫生育力的影响。L1期幼虫染毒48 h,L1期幼虫染毒48 h后,与对照组比较,PFOS和PFOA高、中剂量组后代数目减少具有统计学差异(P<0.05);PFOS的3个剂量组的世代时间差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.3 PFOS和PFOA对L1期him-5线虫生育力的影响PFOS和PFOA分别设3个染毒组(0.1、0.01、0.001 mmol/L)和1个空白对照组,应用后代数目评价PFOS和PFOA对L1期him-5线虫生育力的影响。L1期him-5线虫暴露于PFOS和PFOA 48 h后,将him-5雄虫和同步化后的fog-2雌性年轻成虫按1:1的比例先后挑入杂交试验NGM培养皿,杂交12 h后,将fog-2雌虫单独挑入一个新的带有OP50的NGM培养皿,此后,每36h将fog-2雌虫转入新的种有OP50的NGM培养皿,至fog-2雌虫不再产卵,计数每条fog-2雌虫产生的后代数目。与对照组相比,PFOS和PFOA各个浓度组him-5雄虫杂交后代数目均减少,且具有统计学差异(P<0.05)。3、PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫精子发生的影响3.1生殖细胞计数采用DAPI染色线虫分离性腺法计数生殖细胞。染色后,在荧光显微镜下观察线虫生殖细胞。与对照组比较,PFOS各个剂量组的生殖细胞数减少均有统计学意义(P<0.05);PFOA的中、高剂量组生殖细胞数目的减少均有统计学意义(P<0.05),低剂量组生殖细胞数目减少无统计学意义(P>0.05),随染毒剂量增加,生殖细胞数目减少具有剂量反应关系(R2=0.963)。3.2精子形态大小观测染毒结束后,将线虫洗净,取包埋过的载玻片,加入lOμLSM buffer溶液,挑入10条雄虫,用1mL注射器针头在不超过其尾部三分之一处划破,盖上盖玻片,微分干涉显微镜下观察精子形态和大小并随机拍片。统计200个精细胞,计算其大小和畸形率。暴露48h后,PFOS、PFOA各组him-5雄虫均出现非圆形精细胞。与对照组比较,PFOS高、中浓度组和PFOA高浓度组him-5雄虫精细胞大小(直径)显著降低,具有统计学意义(P<0.0.05)。与对照组比较,PFOS各暴露组非圆形精细胞百分率显著升高(P<0.05),具有剂量效应关系(R2=0.995)。PFOA各暴露组非圆形精细胞百分率显著升高(P<0.05),具有剂量效应关系(R2=0.991)。3.3精子活化实验在已包埋的载玻片上挑入染毒好的线虫,将精细胞用1ml注射器针头分离后,加入10μl 200 μg/ml的Pronase,5分钟后盖上盖玻片,微分干涉显微镜下观察精子活化的程度,计算精子活化率。以是否具有伪足作为判断精细胞是否成功活化的标准。结果显示,与对照组比较,PFOS和PFOA中、高剂量组精子活化率显著下降,具有统计学意义(P<0.05),PFOS和PFOA低剂量组精子活化率下降没有统计学意义(P>0.05)。PFOS、PFOA剂量组精子活化率下降具有剂量效应关系(R2=0.890,R2=0.938)。4、PFOS和PFOA影响秀丽隐杆线虫精子发生的作用机制4.1 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫生殖细胞减数分裂相关基因表达的影响利用RT-qPCR检测减数分裂相关基因的mRNA表达水平。暴露后,与对照组相比,PFOS和PFOA各剂量组wee-1.3基因表达均显著上调(P<0.05);PFOS高、中剂量组和PFOA高剂量组puf-8基因表达水平均显著下调具有统计学差异(p<0.05)。4.2 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫FB-MO复合体相关基因表达的影响与对照组相比,PFOS各剂量组spe-4基因mRNA的表达没有明显变化,PFOA高、中剂量组spe-4基因表达上调,但仅高剂量组显著上调(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组spe-5、spe-6和spe-17基因表达水平上调且具有统计学差异(P<0.05);PFOS各剂量组和PFOA高、中剂量组spe-10基因表达水平下调且具有统计学差异(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组fer-1基因mRNA的表达均明显下调(P<0.05)。4.3 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫精子活化相关基因表达的影响与对照组相比,PFOS各剂量组swm-1和try-5基因mRNA的表达均下调且有统计学差异(P<0.05);PFOA各剂量组swm-1和try-5基因mRNA的表达均下调且有统计学差异(P<0.05)。4.4 PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫精子物质运输相关相关基因表达的影响与对照组相比,PFOS和PFOA高、中剂量组spe-15基因的表达水平下调且有统计学意义(P<0.05);PFOS和PFOA各剂量组spe-26基因表达水平上调且具有统计学差异(P<0.05)。结论江苏某水厂原水、出厂水以PFOA污染为主。作为评价PFOS和PFOA对秀丽隐杆线虫生殖毒性的指标,生殖细胞数目的改变、精子细胞畸形率和精子活化率比后代数目和世代时间敏感。L1期幼虫对PFOS和PFOA比L4期幼虫更敏感,PFOS和PFOA在线虫幼年期发育全程暴露可显著诱导其生殖毒性。PFOS和PFOA可能通过干扰减数分裂相关基因、FB-MO复合体相关基因、精子活化相关基因和物质运输相关基因的表达,使得精子细胞变小、畸形、活化率下降,从而导致生殖细胞数目减少,最终引起后代数目减少而发挥其生殖毒性作用。PFOS对秀丽隐杆线虫的生殖毒性略强于PFOA,PFOS对puf-8、spe-10的抑制作用强于PFOA,而PFOA可显著诱导spe-4的上调,而PFOS对其没有影响。