目的通过比较慢速梯度降温法、Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温法、玻璃化法、慢速连续降温法、直接液氮法、酒精浸泡法对关节软骨组织形态、软骨细胞存活率及软骨细胞活性的不同影响,筛选出保存效果较好的方法,为临床提供一种有活性的异体骨软骨移植物。方法异体骨软骨标本主要来源于泰山医学院附属医院和山东省千佛山医院临床脑死亡病人,无关节病损,捐献者年龄控制在15岁-45岁之间。死前做血尿及其他体液的常规检查。无菌条件下,快速用空心钻在内外侧股骨髁关节面切取直径约为4.5mm的圆柱形骨软骨块,软骨及所带软骨下骨全长约5mm,共500枚,PBS液冲洗3遍备用。将骨软骨块随机分为7组,即对照组、慢速梯度降温组、Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组、玻璃化组、慢速连续降温组、直接液氮组、酒精浸泡组。对照组不采取任何措施,20min内直接取材检测软骨细胞存活率、软骨细胞活性并观察其超微结构。慢速梯度降温组是把标本在降至-40℃以前分4个梯度降温的保存方法;Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组是将骨软骨块用Co⁶⁰射线50Gy剂量照射2个小时后按照慢速梯度降温法保存;玻璃化组即将标本经玻璃化溶液处理后直接以最快的速度投入液氮中保存;慢速连续降温组即传统降温方法,将经低温保护剂处理后的标本分两步降温保存;直接液氮组是将骨软骨块经过低温保护剂处理后直接投放入液氮中保存;酒精浸泡组即将骨软骨块浸泡入75%的酒精中维持72小时,然后更换95%的酒精,4℃保存。各实验组软骨标本于保存8天、15天、30天、60天时取出做台盼蓝检测软骨细胞存活率;MTT检测软骨细胞活性（OD值的大小反映软骨细胞的活性）;进行组织学和组织化学检测观察软骨细胞组织形态和代谢活性变化（番红O染色显示软骨基质蛋白多糖PG变化）;透射电镜观察组织超微结构变化。并以新鲜组作为对照组,对实验组软骨组织保存情况进行比较。结果1.关节软骨PG的变化关节软骨保存8天时,慢速梯度降温组、Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组和慢速连续降温组PG含量（IOD）值同对照组比较有统计学差异（P<0.05）,Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组同慢速连续降温组比较没有统计差异;关节软骨保存15天时,慢速梯度降温组、Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组和慢速连续降温组PG含量同对照组比较减少均有统计学差异（P<0.05）,慢速梯度降温组同Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组和慢速连续降温组比较有统计学差异（P<0.05）;保存30天时,慢速梯度降温组同Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组和慢速连续降温组比较有统计学差异（P<0.05）;保存60天时,慢速梯度降温组、Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组和慢速连续降温组两两比较有统计学意义。慢速梯度降温组、Co⁶⁰射线照射+慢速梯度降温组和慢速连续降温组,四个时间点,这三个实验组内比较,保存处理对PG影响有时间依从性,即保存8天、15天、30天和60天组内两两比较有统计学差异（P<0.05）。玻璃化组、直接液氮组和酒精浸泡组PG含量随保存没有时间依从性,即组内比较没有统计学意义。直接液氮组同对照组比较有统计学差异,玻璃化组、酒精浸泡组在不同时间点上两两比较均没有统计学意义。2.软骨细胞存活率的变化对照组软骨细胞存活率为96.63±0.56,保存8天、15天、30天和60天时,各实验组同对照组比较均有统计学差异（P<0.05）,各实验组组间两两比较均有统计学差异（P<0.05）。除酒精浸泡组外,各实验组组内两两比较均有统计学差异（P<0.05）,即保存处理对各组软骨细胞存活率的影响具有动态时间依从性。酒精浸泡组经实验检测无存活软骨细胞。3、软骨细胞的活性对照组的OD值0.66±0.05。保存8天,各实验组同对照组比较均有统计学差异（P<0.05）,慢速梯度降温组同玻璃化组、Co⁶⁰照射+梯度降温法同慢速连续降温组比较没有统计学意义,其两者比较有统计学意义（P<0.05）;保存15天,各实验组同对照组比较均有统计学差异（P<0.05）,Co⁶⁰照射+梯度降温法同慢速连续降温组比较没有统计学意义,其它各组两两比较有统计学意义（P<0.05）;保存30天,组间比较同保存15天;保存60天,各实验组同对照组比较均有统计学差异（P<0.05）,各实验组组间两两比较均有统计学意义（P<0.05）。各实验组组内两两比较均有统计学意义,即保存处理对各实验组OD值的影响具有动态时间依从性。结论1、慢速梯度降温法和玻璃化法能够明显减轻关节软骨的组织冻伤,提高保存软骨的活性,有一定的临床应用价值。2、酒精浸泡法只能保存软骨的组织结构,其他保存方法对关节软骨活性的影响均具有动态的时间依从性,随着时间的延长,关节软骨活性逐渐降低。3、Co⁶⁰射线照射+梯度降温法与梯度降温组比较软骨细胞存活率降低,说明Co⁶⁰射线照射对软骨有一定的损伤作用。意义:关节软骨缺损临床上很常见,而且治疗很棘手,多种治疗手段已运用于关节软骨缺损的修复,但大多数疗效不理想,修复组织也以纤维软骨为多,缺乏正常透明软骨的生物力学性能及耐用性。组织工程可以很好的用于软骨缺损的治疗,但目前仍处于探索阶段。骨软骨移植可以将完整的正常的关节软骨移植于关节软骨缺损处,提供完整的关节软骨基质和有活力的软骨细胞,恢复关节软骨外形。目前有多种方法用于关节软骨的保存,但这些方法多不成熟,并停留在动物实验阶段,本实验将目前比较好软骨保存方法同传统保存方法做系统的比较,并以人关节软骨为标本,从而使实验结果更真实可靠。