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目的：本课题构建轮状病毒(Rotavirus，RV)非结构蛋白4(Nonstructural protein4,NSP4)及其第86～175 aa(86 to175 amino acid peptide of nonstructural protein4，NSP486-175)基因的原核表达系统，通过转化E.coli BL21(DE3)、IPTG诱导表达、Ni-NTA亲和层析纯化等方法制备重组蛋白。分析NSP4对Caco-2细胞和原代培养的SD大鼠神经元细胞的损伤作用，进一步探讨RV对肠外细胞的损伤机制。 方法： 1.构建pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表达载体胶体金法筛选A群轮状病毒阳性粪便，提取总RNA逆转录为cDNA，PCR扩增出目的基因NSP4和NSP486-175，将目的基因与pMD19-T simple vector连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR和质粒酶切鉴定后送DNA测序。提取pMD19T-N SP4、pMD19T-NSP486-175和pET-28a(+)质粒分别进行双酶切，T4DNA连接酶连接并转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，菌落PCR、质粒酶切鉴定及DNA测序后应用于后续试验。 2.NSP4诱导表达和纯化根据不同IPTG浓度和诱导时间分别对含有pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175的E.coli BL21(DE3)进行诱导表达，分析最佳诱导条件。收集菌体沉淀，高压破碎，SDS-PAGE分析蛋白的表达方式及表达量。破碎后的上清进行Ni-NTA亲和层析纯化，脱盐柱脱盐。取部分纯化蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。 3.RV NSP486-175蛋白对Caco-2细胞胞内游离钙离子(intracellular free Ca2+，[Ca2+]i)干扰作用用PBS溶解重组蛋白，Bradford法检测蛋白浓度。PBS作为阴性对照，Fluo-3标记Caco-2细胞[Ca2+]i，激光共聚焦显微镜检测NSP486-175对[Ca2+]i的干扰。 4 NSP486-175蛋白对神经元细胞的损伤作用分离培养出生24 h的SD大鼠神经元细胞。用不同浓度的NSP486-175刺激成熟的神经元细胞，12h后倒置显微镜下观察细胞状态。收集细胞培养液检测LDH活力，激光共聚焦显微镜观察添加蛋白前后神经元细胞[Ca2+]i荧光强度和分布改变。 结果： 1.构建pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表达载体PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，分别在500bp和300bp左右有预期大小的条带。pET-28a(+)-NSP4和pET-28a(+)-NSP486-175表达载体分别经NcoⅠ、XhoⅠ和NcoⅠ、HindⅢ双酶切，目的基因均与预期大小相符。DNA测序结果与GenBank: AET43469.1序列一致。 2.NSP4诱导表达和纯化完整的NSP4在大肠埃希菌中难以表达。NSP486-175蛋白主要以可溶性方式存在，相对分子质量为10000。NSP86-175蛋白表达量在37℃，0.5mmol/L IPTG诱导7h达到高峰。SDS-PAGE分析NSP486-175蛋白主要存在于菌体破碎离心后的上清中，Ni-NTA亲和层析纯化用不同浓度咪唑洗脱后发现200mmol/L咪唑洗脱下来的目的蛋白最多。纯化后的蛋白能与抗His多克隆抗体结合，Westernblot验证在NC膜上相对分子量10000处有特异性条带。 3.RV NSP486-175蛋白对Caco-2细胞[Ca2+]i干扰作用激光共聚焦显微镜观察到加入NSP486-175前后Caco-2细胞内荧光强度及荧光分布的变化。时间-平均光密度曲线显示加入重组蛋白后平均光密度值立即升高，在24s达到峰值，之后逐渐下降，呈一过性变化未见第二峰;对照组加入PBS后无明显变化。对照组与实验组荧光强度变化差值的比较，t=4.507，P=0.011，差异有统计学意义。实验组添加NSP486-175蛋白前后荧光强度分析，t=8.211，P=0.015，差异有统计学意义，加蛋白后荧光强度增高。 4.NSP486-175蛋白对神经元细胞损伤作用原代分离培养的新生SD大鼠神经元细胞9d左右成熟，倒置显微镜下可见细胞胞体丰满，呈不规则形或梭形，细胞突起变长增粗交错成网络，细胞生长状态较好。不同浓度蛋白刺激12 h后，细胞状态变差，细胞间隙增大，贴壁细胞减少。培养液中50μg/ml组与对照组比较LDH活力升高，500μg/ml组LDH升高最明显。 添加NSP486-175蛋白后胞内钙离子的荧光强度和分布均有变化。时间-平均光密度曲线显示加入重组蛋白后平均光密度值开始升高之后逐渐下降，呈一过性变化未见第二峰;对照组加入PBS后没有明显变化。对照组与实验组荧光强度变化差值的比较，t=3.394，P=0.027，差异有统计学意义。实验组添加NSP486-175蛋白前后荧光强度分析，t=4.362，P=0.049，差异有统计学意义，加蛋白后荧光强度增高。 结论： 1.构建轮状病毒完整的NSP4及其活性片段NSP486-175原核表达系统，对表达过程进行优化，实现了NSP486-175蛋白的大量高效制备。 2.NSP486-175蛋白能够导致Caco-2细胞内游离的Ca2+失衡，初步证实具有生物学活性，可进一步用于轮状病毒肠外损伤机制的研究。 3.外源性添加NSP4后神经元细胞细胞膜完整性受到影响，LDH释放量增高，同时干扰胞内钙离子平衡，表明NSP4可能涉及RV肠道外细胞损伤，且与蛋白浓度相关。