论文部分内容阅读
白桦细胞中富含具有药用价值的三萜类物质,研究报道显示许多信号分子可促进三萜在白桦中的合成积累,而信号间的互作和对内源信号的影响尚未见报道。本研究以白桦(Betula platyphlla Suk.)悬浮培养细胞为材料,利用SA.MeJA.CaCl2及各种Ca2+抑制剂组合处理白桦细胞,检测白桦三萜物质及组分的积累动态、抗氧化酶活性变化,分析了三萜合成途径关键基因的相对表达变化,以期明确Ca2+在介导SA及MeJA诱导白桦悬浮细胞三萜合成中的作用及机制。同时本研究还检测了外源诱导子处理后对胞内JA.SA激素含量,Ca2+-ATPase、NOS的相对酶活性影响,以期明确JA/SA诱导的内源SA、JA和NO的反馈效应、JA/SA自催化合成、引发Ca2+/ROS的信号互作,进而揭示信号分子在三萜合成的作用机制。研究结果如下：1、以白桦细胞为试材,通过在悬浮培养第8天进行SA、CaCl2及其互作处理,研究Ca2+在SA诱导白桦三萜合成中的作用。SA可以诱导白桦悬浮细胞三萜物质(总三萜、齐墩果酸、白桦脂醇、白桦脂酸)的合成及相关基因(FPS、SS、SE、BPW、 BPY、CAS、CAM)的上调表达,且Ca2+的加入使得这种诱导效应更为显著,说明白桦细胞中钙信号分子介导了SA诱导三萜物质的合成途径。对Ca2+抑制剂的研究发现,Ca2+是SA诱导白桦三萜物质合成加强的必要条件,但由于某些时间点并未抑制SA的这种诱导作用,反而进一步促进了代谢产物的合成,暗示白桦细胞中还存在其他信号分子或其他途径共同参与SA诱导三萜物质的合成积累。结合细胞活力、抗逆酶、植物抗逆及NO、JA、乙烯信号相关基因等的进一步研究结果推测,SA诱导使细胞ROS信号传递及响应逆境胁迫,NO、JA和乙烯信号途径参与信号转导,在此过程中Ca2+起到一定的介导作用,促使胁迫信号向下游传递。2、以白桦细胞为试材,通过在悬浮培养第8天进行MeJA、CaCl2及其互作处理,研究Ca2+在MeJA诱导白桦三萜合成中的作用。结果表明,MeJA处理后显著促进白桦细胞中总三萜和齐墩果酸的合成,分别于48h达到最高积累量46.90mg/g和1.31mg／g。MeJA+EGTA和MeJA+LaCl3处理,均降低了MeJA对三萜合成的促进作用,仍显著高于对照。抗逆酶结果显示,CaCl2和MeJA+CaCl2处理均不同程度的提高了CAT.PAL和APX的活性,而SOD的活性则受到Ca2+的抑制；两种Ca2+抑制剂加入后显著影响抗逆酶的活性。荧光定量PCR结果显示,MeJA处理早期(2h),三萜途径各关键酶基因FPS、SS、SE、BPW、BPY显著上调表达。MeJA+LaCl3处理早期(2h)除BPW降低外,BPY、BPX2、SS和SE表达量均高于MeJA单独处理；而同MeJA处理相比,MeJA+EGTA处理2h,BPW、BPX2、SS、SE和FPS表达量均下调。暗示Ca2+参与了MeJA诱导白桦防御系统启动和三萜物质合成,但两种Ca2+抑制剂EGTA和LaCl3在三萜合成中的作用效果和机制存在差异。3、外源激素MeJA和SA对内源信号分子(JA.SA和NO)合成及Ca2+-ATPase酶活性影响的研究表明,SA的加入可在12～120h促进JA的产生；除早期外,外源MeJA添加对信号分子JA也有促进作用。MeJA与SA或SNP组合处理,对内源JA合成的诱导效果低于SA与SNP组合处理,暗示SA更能显著促进内源JA的合成。除120h的所有处理和6h MeJA+SNP外,其他处理及各时间点基本表现对游离态SA积累影响不大或抑制作用,尤其是各处理在24h,表现显著的抑制游离态SA积累。外施MeJA可有效诱导细胞结合态SA含量积累,而外源SA以及其他处理均未显示促进内源结合态SA的积累。研究结果表明,MeJA和SA诱导内源SA, JA和NO的反馈效应,存在JA/SA自催化合成和拮抗作用,并共同参与三萜合成的调控作用。4, MeJA, SA及其互作处理白桦悬浮细胞结果显示,内源NOS和Ca2+-ATPase为各处理早期响应事件,且均在诱导初期(2、6h)达到高峰,而内源JA和SA含量的变化晚于NOS和Ca2+-ATPase活性的升高,Ca2+或Ca2+-ATPase在介导外源SA、 MeJA对内源信号传递过程中发挥重要作用,而NO是位于JA和SA的上游的信号分子,共同参与对白桦三萜合成的调控作用。本研究结果证明SA、MeJA可诱导胞内活性氧变化和防御系统启动,而H202在介导SA、MeJA、NO刺激防御基因表达和次生产物合成中起重要枢纽和关键联系点的作用。综合以上分析表明,Ca2+分别参与介导SA和MeJA诱导白桦悬浮细胞三萜合成过程,且Ca2+信号转导并非唯一途径,存在内源SA, JA信号分子合成的响应,并伴随活性氧迸发及防御酶启动,研究显示NO合成为外源SA和MeJA诱导内源激素合成及防御系统启动的早期事件,并位于SA和JA的上游。MeJA和SA可诱导的内源SA, JA和NO的反馈效应,存在JA/SA自催化合成和拮抗作用,并可引发Ca2+和ROS的信号响应与互作,信号分子的交互对话共同参与和调控三萜物质合成和动态积累。