伴随着工业生产的不断发展进步,氯酚类及联苯类化合物在工业生产中使用广泛,但它们却是一类污染范围广、毒害性大、自身难降解的污染物。目前国内外学者发现氯代芳香族化合物的微生物降解是一种对环境无毒、具有投资少、且无二次污染的优点,这种方法包括两个主要过程:苯环的羟基化和苯环的断裂降解。降解芳香族化合物过程中最关键的步骤之一是初始的羟化反应,是单加氧酶参与的催化的羟化反应,但目前报道应用在降解芳香族化合物中的单加氧酶均具有底物非专一性不强等缺点,因此还不适用于工业治理这些污染物。而我们研究的TfdB-JLU是一种新颖的羟化酶,相比已报道的传统的单加氧酶,该酶具有更广的芳香族底物谱,因此TfdB-JLU这种更复杂的底物非专一性特性对芳香类污染物生物修复十分重要。TfdB-JLU作为一种新颖的羟化酶,与先前报道的TfdB家族酶亲缘关系较远,它是通过宏基因组法提取并外源表达出的一类单加氧酶。虽然该酶与现有其他环境修复用酶相比更具有竞争力,但是工业生产中对酶的催化活性和非专一性要求更高。因此急需要通过蛋白质工程等对蛋白质结构与功能设计,来实现对野生型TfdB-JLU的半理性设计改造,期望获得具备较高活力的TfdB-JLU,同时针对其特有的底物非专一性研究,半理性设计可用来提高该酶的底物非专一性。本论文主要进行了以下研究:(1)首先,我们对TfdB-JLU酶结构和催化氯酚类及联苯类污染物过程的非专一性进行了初步探索。由于还没有得到该酶的晶体结构,我们通过一些与TfdB-JLU序列和结构相似性较高的酶序列和结构的分析,以及酶结构和功能的研究,利用SWISS-MODEL通过结构同源搜索,发现TfdB-JLU与一种近期结构才被解析的2-羟基联苯-3-单加氧酶的序列同源性达到49.1%。因此选择了具有FAD和底物结合位点的2-羟基联苯-3-单加氧酶(PDB:5BRT)为模板同源建模,得到了模拟的TfdB-JLU的三维结构。同时采用Discovery Studio 3.5软件中的Ramachandran plot、Profiles-3D和Z-score值三种评估方式,证实我们同源模建的TfdB-JLU三维模型是合理可信的。(2)酶活性中心是酶催化的关键部位区域,其特定的构象构型对底物结合方式和酶的催化效率有着极大的影响,对酶活性中心区域的结构进行微小改造可能会对酶的性质产生巨大的影响。我们采用分子对接和分子动力学等生物信息学手段对TfdB-JLU与底物复合物的结构模型进行研究,根据酶与底物反应机理筛选对接结果,分析所选取的底物进入TfdB-JLU活性中心区域后,底物2,4-DCP与TfdB-JLU活性中心区域产生相互作用的关键氨基酸,因此确定了关键氨基酸位点,并通过分析对接底物与TfdB-JLU的相互作用方式、作用自由能量等,确定这些氨基酸位点中,Ile48、Trp222、Pro316、Phe424这些疏水性氨基酸与底物2,4-DCP的结合具有重要贡献,通过合理的半理性突变设计策略和高效的酶活性检测方法,筛选得到了对2,4-DCP底物活性提高明显的突变体TfdB-P316Q,该突变体与野生型TfdB相比,对底物2,4-DCP的比活力提高了191.26%,并且该突变体酶的K_m值和野生型相比有明显降低,说明我们筛选得到的突变酶对2.4-DCP底物的亲和力更大。(3)酶活性中心特定的构象构型对底物结合部位的确定、底物的选择性有十分重要的影响。底物结合部位对酶的非专一性影响非常重大,同时底物结合口袋的入口大小及形状,以及底物口袋的疏水性对底物的进入也有十分重要的影响。我们发现并证实P316位氨基酸对TfdB-JLU底物非专一性起关键作用,对于野生型酶相比,突变体酶的底物非专一性增强;也证实His47和Asn116这两个氨基酸对酶底物非专一性也起到非常关键的作用。同时我们发现M251位点位于底物口袋入口,证实了底物口袋大小、疏水性也对酶底物非专一性有明显影响。通过对酶活性中心区域底物口袋大小、疏水性有关的关键氨基酸的突变设计(TfdB-M251A、TfdB-M251G),实现了对酶底物非专一性的调控。本论文探究了活性中心区域半理性设计改造对酶活性、底物非专一性的影响,并结合计算机模拟的手段分析了活性中心区域进化对酶活性、底物非专一性影响的可能原因。探索了可能改变酶酶活性、底物非专一性的半理性设计研究策略。本研究有望对TfdB-JLU活性及底物非专一性的改造调控等做更深、更广的研究。