伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是一种急性传染病,以侵袭动物神经系统和繁殖系统为主要特征。近年来陆续有人感染PRV的报道,因此PRV越来越引起研究人员的重视。本研究设计的针对PRV g B基因和g E基因的双重纳米PCR检测方法,能更好地提高该病的检测效率。目前,针对PRV的手段仍然以预防为主,因此,本试验针对PRV g D蛋白制备了亚单位疫苗,并进一步研究其免疫原性。针对这两部分的主要研究内容包括:1.PRV g B和g E基因双重纳米PCR检测方法的建立本研究参照Gen Bank中公布的PRV毒株(登录号为:KX451219.1),设计特异性PRV检测引物,利用纳米金颗粒,通过优化PCR体系和条件,建立了PRV g B和g E基因双重纳米PCR检测方法。此方法与常见猪源病毒均无交叉反应,表明建立的方法特异性较好。对构建的p MD18-T-PRV-g E和p MD18-T-PRV-g B阳性质粒进行检测,可检测到的最低限分别为1.6×10~2拷贝/μL和1.96×10~2拷贝/μL,其敏感性较普通PCR高出100倍。重复检测阳性质粒,结果均为阳性,表明其重复性良好。对80份不同动物的疑似样品进行检测,本研究建立的方法与普通PCR检测方法符合率为98.8%。结果表明本研究建立的检测方法为单个样本量更小的病料提供了有效的技术支持。2.亚单位疫苗的免疫原性研究本试验通过对PRV g D基因胞外区进行密码子优化,构建p CAGGS-PRV-g D真核表达质粒,并纯化重组蛋白。三次皮下免疫BALB/c小鼠,分别在免疫0 d、14 d、28 d、42 d采血,收集血清。在42 d处死小鼠,分离淋巴结淋巴细胞。测定小鼠血清Ig G并进行血清中和试验,测定淋巴细胞增值率、细胞亚型比例和细胞因子(IFN-γ和IL-4)。结果表明:实验组产生了较高水平的Ig G抗体,g D蛋白的中和效价为1∶132;g D蛋白免疫的小鼠CD3~+CD4~+T淋巴细胞较PBS组升高37.53%,CD3~+CD8~+T淋巴细胞较PBS组升高49.95%;MTT法检测g D组淋巴细胞增殖率较PBS组升高184.18%;g D免疫组小鼠细胞因子检测IFN-γ水平均值是844.04 pg/m L、IL-4水平均值是174.37 pg/m L相比于PBS组均差异极显著。本试验的试验组有不同程度的免疫效果,综合来看,构建的真核表达蛋白有较好的免疫效果。本试验可以为后期制备临床应用的亚单位疫苗打下基础,但也还是需要进一步研究。本试验利用HEK-293F细胞上清表达,纯化更简便、效果更好,为兽用亚单位疫苗打下基础。