隆突性皮肤纤维肉瘤(dermatofibrosarcoma protuberans, DFSP)是一种较为少见的低度恶性软组织肿瘤,临床以缓慢的局部浸润性生长、手术切除后易复发、极少发生转移为特征;其在组织形态学、细胞及分子遗传学上均有一定的特征性表现。随着形态学与分子生物学研究的深入,DFSP目前已为越来越多的病理及临床医生所认识;然而,在临床诊断上仍存在着许多困惑,极易与多种良恶性肿瘤相混淆,其治疗方式及预后又与这些肿瘤大相径庭。尽管一些免疫组化标记物有助于其与部分肿瘤的鉴别诊断,但仍缺乏具有较高特异性的抗体。目前对DFSP的研究绝大多数着眼于临床诊断与手术治疗方面,对其生长机制的研究也以COL1A1-PDGFB融合基因的鉴定居多,甚少有研究着重于其他分子标记物及药物的功能。对其具有更高侵袭性的、预后较差的“纤维肉瘤亚型DFSP”亦缺乏相关机制的探索。以往已有学者运用基因芯片技术分离出在DFSP中具有差异表达的若干基因。本文旨在对其中的Apo D及RARα、RARβ在DFSP肿瘤组织及细胞系中的表达水平进行鉴定,并结合临床资料分析其意义;采用RNAi技术及维甲酸类药物处理,调节Apo D基因在人DFSP细胞系CRL-7043中的表达,研究其与RARα、RARβ表达之间的联系及对细胞增殖水平的影响。通过上述实验初步探讨Apo D、RARα、RARβ在DFSP中的作用机制,筛选对DFSP具有较高特异性的免疫组化诊断标记物,并为临床应用维甲酸类药物治疗手术难以完全切除的DFSP病例提供初步理论依据。Table 1实验设计思路及相关方法、结论简介研究方法:1.构建包括25例DFSP、30例皮肤纤维组织细胞瘤、10例神经纤维瘤、10例恶性纤维组织细胞瘤、4例纤维肉瘤及5例结节性筋膜炎的组织芯片,运用免疫组化及原位杂交检测在这些良恶性病变中Apo D蛋白及核酸水平的表达谱;2.构建包括53例DFSP的组织芯片,运用免疫组化检测RARα、RARβ、COX-2的表达水平,分析其与临床病理资料的相关性;3.运用RT-PCR、Western Blot检测人DFSP细胞系CRL-7043中Apo D、RARα、RARβ的表达水平;4.合成Apo D基因siRNA片段,将其转染至CRL-7043细胞,通过RT-PCR、Western Blot、免疫荧光鉴定干扰效果;5.采用Western Blot检测转染干扰序列后CRL-7043中RARα、RARβ基因表达水平的改变;使用流式细胞术PI染色法检测CRL-7043细胞在转染干扰序列后细胞周期有无变化;6.使用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)、RARα选择性拮抗剂Ro41-5253及RARβ选择性拮抗剂LE-135的不同组合处理CRL-7043细胞;Western Blot检测相应药物作用后,Apo D、RARα、RARβ表达水平的改变;MTT检测不同处理后细胞增殖抑制率的变化;PI染色法检测细胞周期的改变。结果:1.免疫组化Apo D在DFSP中的阳性表达率为92.0%,在皮肤纤维组织细胞瘤中的阳性表达率仅为6.7%,二者之间的表达差异有统计学意义(χ2=36.79,p﹤0.05);2.原位杂交Apo D mRNA在DFSP中阳性表达率为90.91%,在皮肤纤维组织细胞瘤中阳性表达率为7.69%,二者之间阳性表达率的差异具有统计学意义(χ2=33.24,p﹤0.05),且与Apo D的免疫组化表达谱一致;3.免疫组化RARα在DFSP中阳性表达率为98.11%,其中30例为强阳性染色(3级),16例为中等强度阳性染色(2级),7例为阴性或弱阳性染色(1级)。RARα与RARβ、RARα与COX-2表达水平之间均无相关性;4.免疫组化RARβ在DFSP中的阳性表达率为90.58%。其中10例为强阳性染色(3级),13例为中等强度阳性染色(2级),30例为阴性或弱阳性染色(1级);5.免疫组化COX-2在DFSP中阳性表达率为60.38%。其中1例为强阳性染色(3级),32例为中等强度阳性染色(2级),20例为阴性或弱阳性染色(1级)。RARβ与COX-2表达水平之间呈负相关(p<0.001; r=-0.668);6. RT-PCR及Western Blot证实DFSP细胞系CRL-7043表达Apo D、RARα、RARβ基因;7. CRL-7043细胞转染Apo D siRNA干扰片段后,Apo D mRNA及蛋白表达水平显著下调,表明干扰成功;转染后细胞生长周期发生改变,G0/G1期细胞比例明显减少。但RARα、RARβ蛋白表达水平无著变;8. Western Blot显示ATRA处理组CRL-7043细胞中Apo D及RARβ蛋白表达水平升高,但RARα表达水平无著变;9. RARα选择性拮抗剂Ro41-5253可下调CRL-7043细胞中ATRA诱导的Apo D表达水平的升高,RARβ选择性拮抗剂LE-135则无此作用;但二者均可降低ATRA对RARβ表达水平的上调;10. MTT结果显示72h后,ATRA组细胞增殖抑制率高达67.4%±3.5%,而ATRA+Ro41-5253组和ATRA+LE-135组分别为41.2%±5.1%、44.6%±2.8 %,后两者与前者之间差异有统计学意义(p<0.05); PI染色结果显示ATRA处理后G0/G1期细胞比例增加,细胞周期延长。结论:1. Apo D在DFSP中有相对特异性的高表达,可作为临床鉴别诊断DFSP与皮肤纤维组织细胞瘤的免疫组化标记物;2.在DFSP肿瘤组织中,RARα、RARβ的高表达初步提示维甲酸类药物辅助治疗手术难以完全切除的DFSP的可能性;3.在人DFSP细胞系CRL-7043中Apo D的表达水平降低可使细胞周期缩短,细胞增殖水平升高;4.在CRL-7043细胞中,ATRA可能主要通过RARα通路发挥对Apo D的上调作用;5. ATRA可通过RARα、RARβ两条通路抑制CRL-7043细胞的增殖活性。这为临床运用维甲酸类药物辅助治疗手术难以完全切除的DFSP病例提供了初步的理论依据。