研究背景:乳腺癌在现如今世界上是女性最常见的恶性肿瘤,是引发女性死亡的主要原因。目前虽然在治疗水平有了很大的提高,但仍不能使大多数患者受益。“肿瘤起源于肿瘤干细胞”这一学说的提出及对乳腺癌干细胞的深入研究为乳腺癌的治疗提供了新的方向。肿瘤干细胞作为肿瘤组织的起始细胞,不仅具有自我更新和无限增殖的特征,还拥有重建肿瘤组织和放化疗抵抗的能力,也是肿瘤放化疗失败和复发的重要原因所在。近些年来和乳腺癌干细胞相关的信号转导通路的深入研究也为乳腺癌的临床治疗提供了新的依据。盐霉素的分子结构是特殊的环状结构,属于一元羧酸聚醚类,是一种新型的离子载体型抗生素,起初在白色链霉菌中被发现。它能通过中和抵消细胞内的大多数阳离子,对大部分的球虫和各种革兰氏阳性菌均有较强的杀灭作用,且不易产耐药性和抗药性,主要用于治疗家禽球虫病。而近些年,有研究人员提出盐霉素具有抵抗肿瘤的作用特性,且在杀伤乳腺癌干细胞方面比普通化疗药物作用显著。盐霉素可通过Wnt/β-catenin、ER、MAPK以及Akt/NF-k B这些信号转导通路对多种肿瘤细胞发挥作用,并且这些信号转导通路与乳腺癌干细胞也有着密切的联系。而近期关于Notch、Hedgehog信号转导通路的研究提示Notch、Hedgehog通路的异常激活与乳腺癌的产生有着重要的联系。本实验主要为乳腺癌的治疗提供依据,重点说明盐霉素在杀伤乳腺癌干细胞的作用方面与Notch、Hedgehog通路的关系。方法:培养人的乳腺癌细胞系MCF-7,并用不同浓度梯度的盐霉素处理后作用不同的时间。采用CCK-8检测盐霉素对MCF-7细胞生长的影响以及作用48小时后IC50时的盐霉素的浓度;采用克隆形成实验从克隆的形成能力方面观察经盐霉素作用后乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的变化;经流式细胞术观察盐霉素作用48小时后细胞周期的改变;采用流式细胞仪在程序性细胞死亡方面检测盐霉素处理48小时后细胞早期的凋亡的水平的变化:Transwell和划痕实验是从侵袭和转移的角度分析盐霉素对乳腺癌细胞MCF-7的侵袭、转移能力的影响:进一步通过观察乳腺球成球能力上直观分析和流式细胞技术检测CD44+CD24-(乳腺癌干细胞表面标记物)比例的变化;并且用RT-PCR和Western Blot进一步验证乳腺癌干细胞另一重要标记物ALDH1的表达水平;RT-PCR和Western blot检测经盐霉素处理后Notch/Hedgehog通路中靶基因Notch1、Hes1、SMO、Gli1的m RNA和蛋白表达的变化。结果:1.CCK8检测的结果显示:盐霉素能抑制乳腺癌细胞的增殖,且具有时间-剂量依赖性,低浓度的盐霉素(<0.5umol/L)对乳腺癌细胞的抑制作用较弱,当浓度>1umol/L时对细胞的抑制作用明显增强,且48h的IC50为1umol/L。克隆形成实验的结果表明:随着盐霉素浓度的增高细胞的克隆形成能力逐渐减弱。流式细胞仪检测细胞周期水平变化时发现:盐霉素能将细胞周期阻滞在G0/G1期,而S期所占的细胞比例减少(0、0.5、1.0、1.5μmol/L的S期比例分别是45.21%、33.23%、24.39%、11.85%)。采用流式细胞术检测细胞凋亡水平可以观察到:0、0.5、1.0、1.5umol/L的盐霉素处理后细胞早期凋亡水平分别是1.5%,5.65%,17.71%,20.41%。2.流式细胞仪从干细胞表型标记的角度上检测具有CD44+CD24-表型的细胞所占比例的结果显示:经0.5umol/L,1umol/L,1.5umol/L盐霉素处理后的比例分别是0.71%,0.32%,0.18%,显著低于对照组的1.2%。乳腺球成球试验的结果发现:随着盐霉素浓度逐渐增加,乳腺球的体积和数量也逐渐减小。RT-PCR和Western blot结果显示:ALDH1的m RNA和蛋白水平随着盐霉素浓度的增加表达逐渐减少。3.Transwell和划痕实验从侵袭转移层面上检测的结果发现:随着盐霉素浓度的逐渐增加,乳腺癌细胞在侵袭和转移方面的能力逐渐减小。4.采用Western blot和RT-PCR检测ALDH1以及Notch、Hedgehog信号通路中重要分子Notch1、Hes1、SMO、Gli1的表达结果发现:随着盐霉素浓度的增加这些靶基因的m RNA和蛋白的表达逐渐降低。结论1.盐霉素能够抑制乳腺癌细胞的增殖,诱导阻滞细胞的周期,促进癌细胞的凋亡。2.盐霉素能够抑制乳腺癌干细胞。3.盐霉素对乳腺癌干细胞抑制作用的机制可能是通过影响Notch、Hedgehog信号通路实现的。