微分析技术是近年来兴起的一种快速、高效、经济环保的新型仪器分析技术。此类技术充分运用微小容器及管路（直径500μm～10μm），与现有检测技术（如UV、MS、荧光等）相结合，通过空间的集约和聚焦，最大限度地提高反应或检测的效率，并将样品、溶剂的消耗降至最低。至此，分析化学得以提升至纳升水平。微分析技术自问世以来，相关领域研究人员不断进行创新和改进，其应用范围已拓展到化工、生物样品分析、蛋白组学研究、细胞生物学、药物及代谢产物检测等诸多领域，并有大量专利、科研论文和技术成果。对于药物分析领域而言，复杂体系包含天然产物和生物体液样品。对于前者而言，包括中药为主的植物药、动物药和矿物药，它们对于人类的文明与健康水平的提升一直起着至关重要的作用。因此从远古时代起，对于中药及天然药物的研究从未断绝。然而，中药配伍和成分复杂，基质、杂质和各活性成分之间的干扰及相互作用机理较为模糊；因此研究一种药物的成分及其含量，对于其分析方法及仪器技术的要求则更为复杂和高深。而对于生物体液样品，如血浆和体液、组织液样品，由于其样品基质中大量存在的蛋白、干扰离子和其他成分，这会影响药物的提取，降低分析方法的灵敏度和选择性；更何况，药物在体内也未必以游离态存在。因此对于体内生物样品的分离、纯化和富集，而后进行有针对性的检测，这是摆在药物分析工作者面前的难题。因此，分离分析复杂体系需要更为快速、灵敏、高效和专属性较高的检测技术和分析方法，也刺激了仪器分析和相关技术及方法学研究与应用的进步。时至今日，高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法（LC/MS）和紫外分光光度法(UV)依旧是分析复杂体系样品最为成熟可靠的手段。当然，这些方法或多或少存在分离模式单一、效率提升空间有限、样品和溶剂消耗量较大以及小型化受限等缺点。这虽然给分析工作者提出了更多更难的挑战，但也为微分离分析技术的发展提供了广阔的前景。在各种分析技术中，毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是其中应用较为广泛，仪器设备和分析方法较为成熟的一种。它是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。基本原理是，在外加电场作用下，缓冲液中的离子和毛细管内壁的游离硅醇基形成双电层结构，进而产生一个电势，即Zeta电势，产生电渗流（electroosmotic flow, EOF）带动管内离子沿着电场方向迁移。由于缓冲液和待测物离子的电荷-体积比（Charge-size ratio）不同，进而导致各离子在电场中迁移速率的差异。毛细管电泳正是利用这种机理实现了待测物的分离。相较传统电泳，毛细管电泳在25-100μm的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管中进行样品的分离和检测，具有如下特点：容积小（一根100cm×75μm管子的容积仅4.4μL）；侧面/截面积比大，因而散热快、可承受高电场（100-1000V/cm）；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。因此，对比其他传统分析技术（如高效液相色谱法、紫外分光光度法、荧光法和红外分光光度法等），毛细管电泳有多、快、好、省这四方面优势。多——分离模式多。代表性技术有毛细管区带电泳（CZE），等电聚焦毛细管电泳（CIEF），胶束毛细管电动色谱（MEKC）和毛细管电色谱（CEC）等。快——分析时间相对较短。好——分离效率高、柱效好。省——样品溶剂消耗极小，对环境污染破坏少。然而，由于技术的限制，毛细管电泳仍存在一定局限性。例如分离模式相对单一，适用样品范围相对有限和重现性不足等等。为解决此类问题，众多研究者提出了各自的改进方案。如，在运行缓冲液中添加胶束或是手性选择剂以改善分离，采用压力辅助，在毛细管中填充颗粒固定相，或是对毛细管内壁进行修饰、键和等。这些努力在一定程度上提高了毛细管电泳的分离效率，拓展了相关技术的应用范围。作为药物分析领域的研究，本课题将着重于复杂体系的分离分析，结合前人经验、复杂体系特点及毛细管电泳技术的优势，有针对性地将这类快速高效的分析技术应用于药物分析研究中较难攻克的以中药、体内生物样品为代表的复杂体系分析测定中。并在药物质量标准建立、中药指纹图谱研究和体内药代动力学研究以及治疗药物监测等方面，做出可能的改进和贡献。毛细管电色谱技术（CEC）是一种结合了经典液相色谱和毛细管电泳两者优点的分离技术，其中毛细管柱的制备是CEC的核心技术。毛细管填充柱是最为传统和最为成熟的技术之一，流动相通过包裹填料或填充聚合硅胶作为固定相的毛细管柱。但是这种色谱柱也存在很多问题：一方面它需要丰富的填柱经验和娴熟的烧塞技术；另一方面，塞子的引入又常常会在实验时导致气泡产生，使电流中断而影响实验的进行。整体柱技术是在毛细管内经加热和光照引发原位合成连续床层，因而不再需要在柱两端烧塞子，操作也很简单；同时可以根据不同样品官能团的需要，选择不同的有机单体及添加剂进行聚合。因此整体柱技术近来发展迅速，且被广泛应用于蛋白质组学、基因组学、药学、食品和环境领域。CEC相比HPLC的优势在于微流，这保证了它们优良的选择性和灵敏度，以及低样品和流动相消耗。而CEC对比CE的优势在于不论待测物是否带电均可分离，因为此时待测物与固定相间的相互作用成为了可能。传统CEC在微粒固定相中进行，这造成一些问题，如需要填料。而整体固定相带来了新的选择，它无需填料且柱子易于制备。整体柱为点聚合制备，免去了微粒固定相烦琐的填料过程。整体柱中液流通过聚合材料的大孔，与微粒固定相相比，带来了质量转移效应。在毛细管液相色谱中，毛细管液相色谱柱是分离分析的核心，毛细管柱的制备是毛细管液相色谱的关键。毛细管液相色谱柱可根据固定相在柱内的存在方式分为以下三种：开管毛细管液相色谱柱（open tubular capillary columns）、填充毛细管液相色谱柱（packed capillary columns）、整体毛细管液相色谱柱（monolithic capillarycolumns）。整体色谱柱（monolithic chromatographic column），又称棒柱（rod）、连续床（continuous bed），它是由单体、交联引发剂、致孔剂的混合物在色谱柱内通过原位聚合而成的连续床固定相，具有制备方法简单、易于改性、柱效高、渗透性好、可进行快速分离等优点。整体柱按其制备方法的不同分为有机聚合物整体柱和无机整体柱两类，虽然聚合物整体柱具有较好的重复性、化学选材范围广、易于制备、适用的pH值范围宽等优点，但其存在溶胀、受热变形，机械性能差等不足，并且孔径及孔径分布难以控制。由自由基引发聚合而成的整体柱重复性差；紫外引发需紫外透明的毛细管，涂有聚四氟乙烯的石英管虽紫外透明，但聚四氟乙烯与毛细管结合不紧密，毛细管易断。硅胶整体柱则在孔径控制、机械性能、耐溶剂等方面显示出一定的优越性。综上所述，基于整体柱技术的微分离分析方法具有高效率，高速度和较好选择性等特点，但是综合文献调研结果，这些技术在复杂体系特别是我们关心的中药及生物样品方面运用仍然较少，但是它们的特点又决定了它们可以在进行优化后运用在这些领域，因此如何在现有较成熟技术的基础上完善并转化为实用是本课题的一个关键点。本研究具体包括如下工作：首先，我们对毛细管电色谱技术的沿革与发展进行了较为全面的论述。为更为透彻、深刻地把握该项技术不同分支的优缺点，有针对性地选择适当技术进行复杂体系样品的分离分析，我们对目前已经研发出来的不同毛细管色谱柱技术，特别是较为通行的三种，即空管毛细管柱、填充毛细管柱和整体毛细管柱以及他们的修饰和改进进行了调查与研究。通过它们各自特点的对比和适用范围的确证，初步进行有针对性的筛选和分类。同时也对毛细管电色谱技术的发展和特点进行论述，紧紧围绕效率的提升和混合分离机理的引入开展后续研究工作，为发掘此类技术的潜力作出努力。而后，根据文献调研和先期研究的经验，我们选择整体毛细管柱为本课题的主要研究方向。具体原因见相关章节阐述。针对白芷所含的多种香豆素成分，利用其理化性质和结构特点，选取4个活性成分（欧前胡素、珊瑚菜内酯、发卡二醇和异欧前胡素）进行分离和测定。在经过一定的电色谱条件优化后，我们成功对上述化合物进行了分离和定量测定。同时结果也证明，在电迁移和反相分配-吸附机理双重作用之下，毛细管电色谱技术因为集成了毛细管电泳和HPLC的技术特点，因此对于同时分离分析复杂体系内多个组分非常快速和有效。如此一来，便证明了毛细管电色谱技术特别是基于整体柱的毛细管电色谱技术，在分离分析复杂体系样品方面具有广泛的应用前景。之后，我们发现，白芷提取液中仍旧有数个活性成分无法分离，原因在于，虽然这些成分含量较大，但由于结构非常类似，因此无论传统高效液相色谱还是毛细管电色谱技术，实现它们的基线分离，特别是药材基质存在的情况下实现，是较为困难的。研究发现，应用甲基丙烯酸丁酯整体柱，在一定电色谱条件下，能够充分分离结构相似的几个化合物，并对其进行较为准确的定量测定。测定白芷的五个活性成分（花椒毒素、5-甲氧基-8-羟基补骨脂内酯、香柑内酯、水合氧化欧前胡素和白当归素）的过程中，还引入了去氧胆酸钠（SDC）作为“流动固定相”。实践证明，此胶束毛细管电色谱法对于结构类似物的分离有着较大的优势。然而，此柱技术也存在一定局限性：一是样品适应性仍需提升。此类整体柱由于内部结构及所带电荷的特征，多用于分离弱酸性和中性化合物，对碱性化合物实现分离极为困难。第二，也是相当突出的问题在于，甲基丙烯酸丁酯由于碳链较短（C=4），为保证柱效，往往必须聚合出极为紧密的内部结构，这就使得柱通透性大打折扣。低通透性不但会带来较高的背压（>1500psi），内部多小孔的构造也容易产生气泡，进而带来电流中断和容易堵塞等严重问题。故针后续研究必须针对此类问题进行改进。由于甲基丙烯酸丁酯整体柱已经有较多应用实例，且本课题组将其成功用于分离分析白芷中香豆素类似物。对于同样含有大量香豆素成分的蛇床子，在一些方面仍有潜力可供挖掘。其中，蛇床子药材的提取仍然停留在使用超声、回流等传统技术的阶段，缺乏自动化程度较高、提取快速高效的技术手段。加速溶剂萃取（ASE）提供了一个很好的解决方案，大大提升了药材的提取效率。在ASE的帮助下，样品更为富集，纯度也大大提升，实现了最优实验条件下对蛇床子素和欧前胡素的快速、同时测定。在成功进行了两种药材活性成分的测定后，为拓展CEC的应用前景，并测试其对体内生物样品分析的适应性，我们将对蛇床子的研究深化到其体内药代动力学参数的监测上来。选择70%乙腈作为样品溶剂，动物实验所采集的血浆样品使用蛋白沉淀法进行前处理，而后测定目标化合物的药代动力学曲线。结果显示，甲基丙烯酸酯毛细管整体柱在柱效、灵敏度和耐用性等方面符合体内药代动力学研究的要求，能够适用于体液样品的分离分析。针对甲基丙烯酸丁酯整体柱存在的通透性较差，易产生气泡等缺点，为适应快速大通量分析并使整体柱实现在线冲洗，采用以硅胶-ADDA混合整体柱为技术基础的新固定相。此类无机-有机混合整体柱，是有机固定相和硅胶基质在催化剂作用下发生聚合反应产生带季氨基的阳离子单体。其电渗流特征与甲基丙烯酸丁酯整体柱类似，但机械强度更好，通透性极佳，可完全实现柱上冲洗。此无机-有机混合整体柱被成功运用于与在线微透析采样技术结合，测定大鼠中头孢地尼的药代动力学参数。同时，此技术与微透析采样相结合，实现了在线、实时采样和动态监测。结果显示，此方法具有高自动化、快速、高效、灵敏度高、重现性好等特点。大大拓展了整体柱在复杂体系分析中的应用。最后，在进行了上述一系列研究之后，仍然有诸多问题没有得到解决。诸如电色谱整体柱制备和保存较为麻烦，重现性不易保证，分析测定前的平衡需要较长时间，仪器小型化仍需努力等等。这些限制毛细管电色谱技术发展的缺点和弱项仍有待于后续研究者的努力。因此本课题在所完成内容的基础上，对此类技术在未来的发展进行一些展望和构想，旨在对将来该领域的技术发展趋势进行预测和分析，如果稳定性、通透性和重现性能在目前发展的基础上进一步提高，仪器的灵敏度能够继续提升，那么，基于整体柱的复杂体系微分离分析技术，将迎来更为灿烂的明天。