目的:化学治疗在肿瘤治疗中占有很重要的地位,尽管近年来新的化疗药物不断出现,化疗方案不断改进,恶性肿瘤表现出来的耐药性一直是复发、转移乃至治疗失败的主要原因,这是临床肿瘤治疗最常见和最难克服的问题。肿瘤耐药性可分为先天性耐药(natural resistance)和获得性耐药(acquired resistance),前者表现为肿瘤细胞对抗癌药物的天然不敏感,后者为肿瘤细胞因抗癌药物诱导或其他因素的激活而产生耐药性。有文献报道,一些难治、复发的肿瘤患者经用细胞因子和抗癌药物共同治疗后,可以再次获得缓解,从而提示细胞因子可能对逆转耐药有着一定的作用,如:肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-2(IL-2)、a-干扰素(IFN-a)、粒/单细胞集落刺激因子( GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等。很多文献报道细胞因子包括TNF通过下调MDR mRNA的表达、减少P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的合成、抑制P-gp的功能等多种途径来改变肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,而通过诱导肿瘤细胞凋亡来逆转耐药的报道还不多见。细胞凋亡与肿瘤的发生发展有非常密切的关系,诱导肿瘤细胞凋亡可以成为治疗恶性肿瘤的新策略。近年来,国内外研究已证明许多因素可调控肿瘤细胞凋亡,如细胞因子、癌基因、某些中药等。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是来源于巨噬细胞和单核细胞的细胞因子,在体内有抗肿瘤活性,不仅能活化肿瘤血管导致组织出血坏死,而且能诱导肿瘤细胞凋亡。本试验以我校病理教研室自建的小鼠腹水型肝癌细胞亚系Hca/16A3-F为细胞株,建立小鼠皮下种植瘤模型,用依托泊苷(Vp-16)治疗,诱导该肿瘤细胞耐药,一周后建立耐药模型,再用重组人肿瘤坏死因子α衍生物K2(Rh-TNFα-Dk2)治疗,通过电镜下的形态学观察以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2的蛋白表达情况,来研究TNF-α能否诱导对Vp-16耐药的肿瘤细胞凋亡,为克服耐药寻找新的途径。方法:Hca/16A3-F细胞复苏后取第二代腹水,离心后用生理盐水调整肿瘤细胞浓度为1×106/0.2ml,615小鼠右侧腋下皮下注射接种,每只0.2ml,接种后第5~7d出现肿瘤,待种植瘤长至6~10mm时,将小鼠随机分为4组:阴性对照组(小鼠自然生长)、阳性对照组(Vp-16)、单药组(Rh-TNFα-Dk2)和联合组(Vp-16+ Rh-TNFα-Dk2),每组20只,雌雄各半。各组自接种第8d开始给药,均为瘤内注射。Vp-16连用3d,Rh-TNFα-Dk2连用8d。联合组小鼠应用两种药物须间隔一周。从治疗开始的前1d(种瘤第7d),即用游标卡尺测量皮下种植瘤的最长径及与之垂直的最宽径,每隔1d测量并记录,计算瘤体直径均值。接种第28d随机脱颈处死各组一半的小鼠,称取瘤重,计算质量抑瘤率。取新鲜瘤组织,一部分用10%的甲醛固定,常规石蜡包埋,连续4μm切片,用于HE染色常规病理学检查和免疫组织化学染色,检测bcl-2和bax蛋白在肿瘤组织中的表达情况。另一部份用戊二醛固定,常规制备透射电镜标本,超薄切片机切片,透射电镜下观察各组瘤细胞的凋亡情况的差异。各组另一半小鼠在相同条件下喂养,观察各组小鼠生存期的长短。结果:1.由于Vp-16和TNF-α的副作用,Vp-16组、TNF-α组及联合组均有不良事件发生。2.各组荷瘤大小:治疗前(种瘤第7d):各组之间瘤体直径均值比较均P>0.05,无统计学差异;种瘤第10d:联合组和阴性对照组比较P<0.05,有统计学差异,和Vp-16组、TNF-α组比较P>0.05,没有统计学差异;种瘤第16d及22d:联合组和阴性对照组、TNF-α组比较P<0.01、P<0.05,有统计学差异,和Vp-16组比较P>0.05,没有统计学差异;种瘤第28d:联合组和阴性对照组、TNF-α组比较均P<0.01,有统计学差异,和Vp-16组比较P>0.05,没有统计学差异;种瘤第34d:联合组和阴性对照组、TNF-α组比较均P<0.01,和Vp-16组比较P<0.05,差异显著,有统计学意义。3.第28d处死小鼠时的瘤重及抑瘤率:在第28d,各组之间瘤重比较均P<0.01,差异显著,有统计学意义。Vp-16组、TNF-α组、联合组的抑瘤率分别为48.97%、24.20%、72.49%。可以看出联合组在控制瘤重方面优势最为明显,其次为Vp-16组和TNF-α组。4.生存期比较:联合组和阴性对照组、Vp-16组、TNF-α组比较,P<0.01,差异显著,具有统计学意义。Vp-16组、TNF-α组、联合组的延命率分别为26.34%、22.76%、53.20%。可以看出联合组在延长生存期方面优势最为明显,其次为Vp-16组和TNF-α组。5.HE染色光镜结果:联合组肿瘤细胞呈片状、条带状坏死,肿瘤组织细胞核碎裂、溶解,部分坏死组织呈均质红染无结构区域,其坏死灶明显多于Vp-16组、TNF-α组及阴性对照组。经统计学分析,各组之间肿瘤内坏死组织面积百分比比较,均P<0.05差异显著,具有统计学意义。6.电镜结果:联合组凋亡细胞很多,很重,很典型,并且展示了凋亡过程的不同阶段。而Vp-16组和TNF-α组镜下所见,凋亡细胞不是很多,不典型。阴性对照组自发凋亡的细胞更少。7.免疫组织化学染色分析:bcl-2蛋白的表达情况:bcl-2蛋白的表达量最多为阴性对照组,依次为Vp-16组、联合组、TNF-α组。除TNF-α、联合组之间比较P>0.05,差异没有统计学意义之外,其他各组之间比较P<0.05或P<0.01,差异显著,具有统计学意义。bax蛋白的表达情况:bax蛋白的表达量最多为联合组,依次为TNF-α组、Vp-16组、阴性对照组。除TNF-α、联合组之间,Vp-16组、TNF-α组之间比较P>0.05,差异没有统计学意义之外,其他各组之间比较均P<0.01,差异显著,具有统计学意义。结论:1.联合组在抑制肿瘤增殖方面具有明显优势。2.联合组能显著延长荷瘤小鼠的生存期。3.Rh-TNFα-Dk2对耐Vp-16的肝癌种植瘤除了直接的杀伤作用外,还能诱导肿瘤细胞凋亡,可能的机制为上调促凋亡基因bax的表达并下调抑凋亡基因bcl-2的表达。