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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的猪、牛、羊等多种动物共患的急性传染病,猪是其主要宿主,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前尚无针对伪狂犬病的特效药物,预防性疫苗接种是控制该病发生和流行的主要手段。本研究从一猪场送检的病料中分离到一流行变异株PRV JL14,通过同源重组缺失其gI/gE、TK基因,构建了重组病毒JL14-ΔgI/gE/TK,并针对本重组病毒的特性进行了初步研究,为伪狂犬病疫苗的研制提供了特性良好的候选株。本研究的具体内容如下:1 PRV JL14株的分离鉴定本研究开始于2014年自吉林市某猪场的流产仔猪,采集其脑部组织在BHK-21细胞上分离到PRV病毒。病毒粒子经过透射电镜观察具有典型的疱疹病毒结构。通过PCR扩增出病毒gB、gC基因片段,经测序及进化树分析,确定其为2011年后的国内流行株,属于变异株,将其命名为PRV JL14株。2基因缺失性PRV JL14-ΔgI/gE/TK株的构建本研究以PRV JL14为模板,通过PCR扩增出gI/gE基因左右序列LgIgE、RgIgE和TK基因左右序列LTK、RTK作为同源臂,插入pUC19载体,获得转移载体pUC-ΔgI/gE、pUC-ΔTK。通过PCR获得pEGFP-C3载体中的EGFP表达盒,在In-Fusion酶作用下插入左右同源臂之间,获得转移载体pUC-ΔgI/gE-EGFP、pUC-ΔTK-EGFP。将PRV JL14、转移载体pUC-ΔgI/gE-EGFP通过LipofectaminTM 2000转染试剂共转染BHK-21细胞,待细胞出现病变后收获病毒,在荧光显微镜下通过空斑纯化法筛选得到重组病毒PRV JL14-ΔgI/gE-EGFP。将PRV JL14-ΔgI/gE-EGFP与转移载体pUC-ΔgI/gE共转染BHK-21细胞,空斑纯化法反向筛选得到重组病毒PRV JL14-ΔgI/gE。采用以上同样的方法,将PRV JL14-ΔgI/gE先后与转移载体pUC-ΔTK-EGFP、pUC-ΔTK共转染BHK-21细胞,得到PRV JL14-ΔgI/gE/TK病毒。对3个基因缺失的PRV JL14-ΔgI/gE/TK病毒进行PCR扩增并测序,结果表明,PRV JL14-ΔgI/gE/TK在gI/gE基因处缺失2681 bp,在TK基因处缺失912 bp。3 PRV JL14-ΔgI/gE/TK株生长特性和免疫原性研究本研究绘制了重组病毒PRV JL14-ΔgI/gE/TK和PRV JL14在BHK-21细胞上的一步生长曲线,未见二者之间明显差异,病毒增殖滴度均可在30h内达到107.5TCID50/mL以上。将不同剂量的PRV JL14-ΔgI/gE/TK接种仔猪后,仔猪体内产生抗体但无任何临床以常异常表现,说明毒株对靶动物安全;免疫PRV JL14-ΔgI/gE/TK的仔猪在用PRV JL14攻毒后无发病症状,体内gE特异性抗体仍为阴性。以上研究结果表明,本研究获得的PRV JL14-ΔgI/gE/TK株对猪具有良好的安全性和免疫原性,具备了PRV疫苗候选株的基本特性,对于目前PRV变异株的流行防控具有重要的意义。