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X-连锁迟发性脊椎骨骺发育不良(X linked spendghoepiphysed dysplasia tarda，SEDL)是一种主要累及脊椎椎体和身体承重大关节，具有高度遗传异质性的骨软骨发育不良。临床表现为短躯干性侏儒，严重者可引起脊柱活动受限和脊柱侧弯，身体近端承重大关节(主要累及髋关节)出现退行性骨关节炎，伴有颈短、肩峰高耸和桶状胸；X线检查可见椎体普遍变扁，椎体前部上下缘凹陷、中后部呈驼峰状突起和椎间隙狭窄等改变。SEDL是X-连锁隐性单基因遗传病，男性发病；女性携带致病基因，一般表型正常。 1939年Jacobsen首次报道了一个SEDL大家系，以后在世界范围内陆续报告了几十个不同种族来源的SEDL家系。1988年Szpiro-Topia等通过连锁分析将SEDL基因定位到X染色体短臂远端。随后的研究报道将SEDL基因的侯选区域逐步缩小到1-2cM的图距。1999年Gedeon等将候选基因缩小到DXS16和AFMa124wc1之间约170kb的染色体区域内，最后从该区域内的四个候选基因中确定了SEDL基因。 SEDL基因具有高度的等位基因异质性，迄今国外在不同种族来源的SEDL家系中共发现二十余种SEDL基因突变型，但对基因突变如何影响mRNA转录和蛋白翻译的研究较少。传统的疾病诊断方法都是以疾病表型改变为依据，但表型改变很多并不是特异的，出现时间也较晚，往往不能及时、及早地明确诊断，失去早期预防和治疗的机会。基因诊断可以帮助确诊现患者，估计预后；还能诊断症状前患者，给他们的生活方式提出合理建议；更重要的是检出女性携带者，为她们提供遗传咨询，指导生育，避免患儿出生，提高人口素质。目前在国内外尚未见对SEDL进行基因诊断的报道，国内对本病仅见少量临床病例报告，尚无对本病的分子遗传学研究报道。本课题在国内率先对汉族人中一个SEDL大家系郑州大学2003年硕士研究生毕业论文X·连锁迟发性脊椎骨髓发育不良的分子遗传学研究进行了较深入的分子遗传学研究。对象与方法 研究对象为中国河南地区的一个累及五代家庭成员的SEDL大家系，该家系符合X一连锁隐性遗传。受试对象为包括先证者在内的21名家系成员，为排除变异突变，将15例无血缘关系的健康献血者设为对照，男10例，女5例。从受试者外周抗凝血中提取DNA和RNA，一80℃保存备用。为明确中国汉族人SEDL家系是否存在种族遗传异质性，首先用聚合酶链反应(polymeraso chaln reaction，pCR)和变性聚丙烯酞胺凝胶电泳印olyae叮lamide gel eleetrophoresis，PAGE)检测微卫星DXS16的多态性，以此对该家系21名成员进行连锁分析，判定SEDL基因与DXS16是否连锁并对家系中的受试对象进行基因诊断。用PCR扩增产物双向直接测序方法检测患者构成SEDL基因开放性阅读框(open reading斤姗e，ORF)的第3~6外显子及相邻侧翼区的DNA序列，将测序结果与GenBar水公布的SEDL基因正常序列对比找出致病突变，然后在家系其他成员中证实该突变。从患者，携带者和正常对照外周血中提取总RNA，逆转录合成cDNA，以此为模板进行RT一PCR，对PCR扩增产物采用双向测序和非变性PAGE，进一步对SEDL基因mRNA转录本进行分析。结果 从PAGE结果可以看出两个受累者(W，7、V3)DXsl6的基因型相同，四个已知的女性携带者(mlo、mlZ、IVI，、VS)均携有该等位基因，而携带者ml。的表型正常的男性后代W;3、WI。不携带该等位基因，表明该基因与SEDL致病基因连锁;女性携带者DXS16的另一等位基因则与她们表型正常的父亲或母亲的基因型相同，也就是说，其与野生型SEDL基因连锁。该家系中的6位待诊对象(W1;、W;。、WZI、IV23、V4、V7)中W，;、Wl。、WZ;、V7都有与致病基因连锁的DXS16等位基因，因而她们是SEDL致病基因携带者;WZ。的两个DXS16等位基因均与野生型S石D乙基因连锁，故她是正常女性;V4的DXS16等位基因与野生型SEDL基因连锁，说明他是正常男性。单体型分析没有发现基因重组事件，表明DXS16与SEDL基因紧密连锁，待诊者通过连锁分析都得到了明确诊断。 在2例患者(W:5、V3)S忍D乙基因第2内含子剪接受体处发现IVsZ一ZA一C突变，4个外显子的核昔酸序列未见改变。该突变在4位女性携带者得到证实，她们的基因型表现为野生型与突变型杂合现象。家系中2个未受累男性和巧个郑州大学2003年硕士研究生毕业论文X一连锁迟发性脊椎骨髓发育不良的分子遗传学研究无关健康个体未测到这一突变，说明IVSZ一ZA一C突变是致病突变。在该家系还检测出4个未知的携带者。 对该SEDL家系男性受累者SEDL基因cDNA正，反双向测序结果发现了两种类型的。DNA:一种cDNA第二外显子与第四外显子拼接，显示外显子3缺失;另一种cDNA的第一外显子与第四外显子直接拼接，意味着外显子2和3同时缺失。随后对女性携带者SEDL基因cDNA的测序结果也发现外显子1与外显子3拼接，显示外显子2完全缺失。对SEDL患者、女性携带者和正常人的SEDL基因。DNA非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳结果显示:SEDL患者存在两种扩增片段，长度分别为567bp和425饰，前者提示外显子3丢失，后者为外显子3和2同时缺失;正常人的SEDL基因cDN