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阿魏酸酯酶又称肉桂酸酯酶,是微生物细胞壁降解酶库中的一类酶,属羧酸酯酶的一个亚类,结合纤维素水解酶来裂解不溶性的细胞壁,释放阿魏酸。因此,该酶在食品工业、造纸工业、饲料生产及生物能源等领域表现出良好的应用前景。该酶提取的方法主要有植物提取、化学合成及生物合成,植物提取和化学合成成本大,经济收益差,生物合成具有耗能低,污染小等特点逐渐成为研究热点,但目前的野生菌株发酵尚不能满足工业化生产的需求。本论文通过自然界中筛选出丝状真菌,使用阿魏酸乙酯平板法,得到可以产生阿魏酸酯酶的菌株。选择其中一株阿魏酸酯酶产量高的菌株W2,提取DNA鉴定其种属。对其发酵培养基进行优化。克隆其阿魏酸酯酶的基因,以毕赤酵母为宿主,成功构建重组菌GS115-pPIC9K-FAE,初步对其培养基进行优化,及上罐进行高密度发酵获得更高的酶活。主要研究内容如下:(1)从自然界土壤中筛选出43株丝状真菌,复筛获得8株具有产阿魏酸酯酶的丝状真菌,对其巨大菌落形态和显微结构进行观察,8株丝状真菌具有不同的菌落和孢子形态。对这8株丝状真菌使用基础发酵培养基发酵后,发现一株编号为W2丝状真菌产的阿魏酸酯酶活力最高。以菌株W2染色体DNA为模板进行PCR扩增,所得5.8S ITS-rDNA序列经测序、同源比对(Blastn)和系统发育树分析表明,菌株W2为土曲霉。(2)通过单因素和爬坡试验后,使用响应面试验设计对该菌株进行了液态发酵培养基优化,得到该菌株产阿魏酸酯酶最优培养基配方为:葡糖糖 3%,啤酒糟 2.45%,豆渣 8.1%,FeSO4·7H2O 0.001%,KCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO4 0.1%,pH 5.0。利用上述培养基在摇瓶发酵条件下得到最高酶活为205 U/L,约为优化前的3倍。(3)设计引物克隆得到阿魏酸酯酶基因,通过DNAMAN软件设计优化,去除了内含子和信号肽,在基因的上游和下游分别引入限制酶EcoR Ⅰ和SnaBⅠ的识别位点,由公司全合成基因,基于毕赤酵母的表达载体,构建pPIC9K-FAE表达载体,实现阿魏酸酯酶基因在毕赤酵母GS115中表达,通过单因素实验确定最佳诱导条件为诱导初始菌体OD600=2,诱导pH为6,诱导温度为28℃。在摇瓶中利用此条件可获得最高酶活为3025 U/L,利用10 L发酵罐对重组菌GS115-pPIC9K-FAE进行高密度发酵可获得最高酶活为20918 U/L。