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烷氧化酶普遍存在于降解烷烃的微生物中,其作用底物广泛,在环境污染物的净化过程中发挥着重要作用。目前对短链烷烃(C1-C10范围内)氧化酶研究较为充分,而作用于中长链和长链烷烃的氧化酶却知之甚少。在前期的实验中,课题组分离筛选出一株能快速降解各种烃类的细菌-铜绿假单胞菌NY3。本文研究该菌株烷氧化酶基因及其作用,对揭示其代谢石油烃的机理有重要意义。本论文以野生铜绿假单胞菌NY3为研究对象,利用分子生物学技术构建烷氧化酶基因突变株,并以气相色谱、气相色谱-质谱及其他分析手段,通过研究野生菌株和突变株代谢烃的差异性,揭示了烷氧化酶基因alkB1与alkB2在铜绿假单胞菌NY3降解烃过程中的作用,得出以下结果。(1)成功调取铜绿假单胞菌NY3细胞中alkB1和alkB2基因,并分别构建alkB1和alk B2单基因突变株NB1D、NB2D菌株及双基因突变菌株NB12DD。(2)研究发现,alkB1基因降解短链烷烃(C13、C14)的作用大于alkB2基因,而alkB2基因则在中长链烷烃(C16,C19,C21,C22,C24,C25,C28)降解中发挥重要作用。菌株NB12DD能以单一烷烃为唯一碳源生长,说明除alkB1和alkB2基因外,NY3菌还有其他烷烃降解基因。(3)铜绿假单胞菌NY3以混合烃(原油)为唯一碳源生长时,降解反应前期,基因alkB1与alkB2对短链烷烃的降解有明显的促进作用。而同时敲除alkB1与alkB2基因,对于中长链和长链烷烃(C16-C32)的降解能力明显下降。降解反应后期,alkB2作用比alkB1更大。(4)铜绿假单胞菌NY3及其突变株均能同时去除原油中直链烃和多环芳烃(原油中所含的菲、芘)。野生NY3菌对原油中菲和芘的去除率比三株突变菌株高,证明alkB1和alkB2基因在野生菌NY3降解多环芳烃过程中发挥重要作用。(5)各菌株均能通过逐步氧化、脱羧及其开环裂解等途径将菲转化成中间产物—反-丁烯二酸。野生菌NY3和双突变菌株NB12DD降解菲时,更易积累含不完整环的代谢物和具有还原性的产物,如丁烯二酸、3(2-羟基苯基)丙烯酸、丁二酸、1,2-二氢-1-菲、3-(1-甲醛基萘基)丙烯酸、5(2-甲醛-苯基)-3-氧代-4-戊烯酸等。而单突变株NB1D和NB2D代谢菲的中间产物则较为单一。上述结果为进一步研究铜绿假单胞菌NY3中作用于中长碳链的烷氧化酶和对于开发各菌株对难降解有机物的降解功能等奠定了研究基础。