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第一部分大鼠肾脏足细胞的原代培养目的:通过原代培养,获得生物学特性更稳定和更接近于体内的足细胞,为后续实验提供基本保证。方法:用高压蒸汽灭菌的手术器械,从大鼠体内分离肾脏,剥离肾被膜、分离肾脏皮质,然后用剪刀剪碎,分别以大小不同的筛网筛离(75、18目筛网),以DMEM/F12培养基悬浮筛离的的肾小球,然后接种于培养瓶中(事先将Ⅰ型胶原包被在培养瓶内壁)。通过对大鼠肾脏足细胞特异标志蛋白进行免疫荧光染色(WT-1和Synaptopodin蛋白),对足细胞进行鉴定。结果:从大鼠肾脏分离肾小球后,培养第5天可见细胞克隆从肾小球周围爬出,这些细胞在形态学上表现出多边形等上皮细胞的形态,通过免疫荧光染色,WT-1和Synaptopodin蛋白均呈阳性。结论:以差异过滤法分离肾小球,以WT-1和Synaptopodin作为鉴定足细胞的特异标志蛋白,确认得到原代培养的的大鼠足细胞。第二部分足细胞内PPARγ的表达与定位目的:研究足细胞内PPARγ的表达和定位。方法:分别以RT-PCR和Western blot方法,对大鼠足细胞PPARγm RNA和蛋白水平进行检测,同时通过免疫组化染色观察PPARγ在足细胞中的定位。在此基础上,分别以罗格列酮10μM和吡格列酮1μM处理足细胞24小时,检测PPARγ在足细胞中的表达变化。为了进一步检测作为转录因子PPARγ的生物学活性,以包含PPRE的荧光素酶报告基因质粒PGL3-PPRE和对照质粒PRL-TK共同转染足细胞,检测PPRE的荧光素酶活性。结果:经RT-PCR检测,正常大鼠肾脏足细胞中表达PPARγ。以吡格列酮或罗格列酮分别处理足细胞,可见足细胞内PPARγ蛋白表达增加,与正常对照组相比,有统计学意义(P<0.05)。免疫组化染色显示PPARγ阳性染色位于细胞质、细胞核和足突。吡格列酮和罗格列酮处理的足细胞,其PPRE荧光素酶活性增强,与对照组相比,有显著差别(P<0.05)。结论:在大鼠肾脏足细胞有PPARγ表达;吡格列酮和罗格列酮诱导PPARγ在足细胞的表达,并增强其PPARγ转录活性。第三部分PPARγ激动剂在TGFβ诱导足细胞产生Ⅳ型胶原中的作用的实验研究目的:通过研究PPARγ激动剂对TGFβ诱导的足细胞Ⅳ型胶原的表达影响,探讨PPARγ激动剂在足细胞产生Ⅳ型胶原中的作用。方法:在TGFβ10ng/ml诱导24小时后,分别以罗格列酮10μM和吡格列酮1μM继续处理24小时,用ELISA方法检测各组足细胞培养上清Ⅳ型胶原蛋白的浓度,同时用免疫荧光染色的方法观察Ⅳ型胶原蛋白的荧光表达强度,之后以Ad-PPARγ-EGFP病毒质粒转染足细胞或以GW9662处理各组足细胞24小时,收集标本检测Ⅳ型胶原蛋白在各组中的表达水平。结果:足细胞培养上清Ⅳ型胶原蛋白浓度,在TGFβ组增加明显,与Control组相比差异显著(P<0.01),而在TGFβ+Rosi组或TGFβ+Pio组则明显减少,与TGFβ组相比差异显著(P<0.05)。足细胞PPARγ蛋白的表达,与Control组相比,Pio组或Ad-PPARγ组增加,其中Ad-PPARγ组与Ad-vecto组相比增加6倍。Ⅳ型胶原的免疫荧光强度在TGFβ组明显增强,而TGFβ+Pio组与Control组相比无明显差别。足细胞内Ⅳ型胶原m RNA和蛋白水平在TGFβ组明显增加,与Control组相比差异显著(P<0.05),而TGFβ+Rosi组或TGFβ+Pio组则明显减少,与TGFβ组相比有统计学意义(P<0.05)。足细胞内Ⅳ型胶原蛋白表达,在TGFβ+Ad-PPARγ组减少2-3倍,与TGFβ组相比,差异显著(P<0.05),而TGFβ+GW9662组表达明显增加,且与Control组和TGFβ+Pio组相比,均有明显差异(P<0.05),TGFβ+Pio+GW9662组与Control组相比无明显差别。结论:TGFβ诱导Ⅳ型胶原在足细胞中的表达;PPARγ激动剂或PPARγ在足细胞的过表达均可抑制Ⅳ型胶原蛋白的产生,而GW9662减弱了这种抑制作用。第四部分PPARγ激动剂抑制TGFβ诱导足细胞Ⅳ型胶原产生的机制研究目的:通过对TGFβ诱导下的P-Smad2/3蛋白表达和Ⅳ型胶原基因SBE荧光素酶活性变化的研究,探讨Pio对TGFβ/Smad通路的影响,以及PPARγ激动剂在TGFβ诱导足细胞产生Ⅳ型胶原的机制。方法:以TGFβ10ng/ml诱导足细胞,给予或不给予Pio处理,分别在0、15、30min时用Western blot方法检测足细胞内P-Smad2/3蛋白表达的变化。以promoter软件进行启动子分析,对Ⅳ型胶原基因上的SBE进行预测,然后分别在各处理组细胞对此SBE序列的荧光素酶活性进行检测。结果:TGFβ诱导足细胞内P-Smad2/3蛋白的表达增加,并随时间的延长而增加;在每一个时间点,TGFβ+Pio组细胞内P-Smad2/3蛋白表达均减少,与TGFβ组相比,有统计学差异(P<0.05);TGFβ诱导下Ⅳ型胶原基因SBE荧光素酶活性增加,而TGFβ+Pio组和TGFβ+Rosi组其活性明显下降,与TGFβ组相比有统计学意义(P值分别为P<0.01和P<0.05)。结论:TGFβ可诱导磷酸化Smad2/3的表达,并且是呈现时间依赖性;PPARγ激动剂抑制TGFβ所诱导的P-Smad2/3蛋白在足细胞中的表达;PPARγ激动剂使Ⅳ型胶原基因SBE荧光素酶的活性下降。