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【研究背景和目的】背景:胰腺癌是常见恶性肿瘤,具有高度恶性、转移早、一年病死率高等特点,目前尚缺乏有效治疗手段。免疫抑制是胰腺癌肿瘤微环境(Tumor micro-environment,TME)具有的特点之一,是胰腺癌早期转移、化疗不敏感/耐药的重要免疫学原因。程序死亡配体-1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)/程序死亡受体-1(Programmed death-1,PD-1)通路是体内广泛存在的负性免疫调节通路,对于健康人群避免有害自身免疫反应具有重要意义。现有众多研究发现,在各类恶性肿瘤中PD-L1/PD-1通路表达显著增加,诱导免疫细胞凋亡增加,是肿瘤免疫抑制产生的重要调节机制。PD-L1广泛存在于各类器官、循环系统和肿瘤组织中,主要受到细胞所在微环境(如IFN-γ、microRNAs等)影响被动产生。PD-L1主要存在形式可分为膜性PD-L1(membrane PD-L1,mPD-L1)和可溶性PD-L1(soluble PD-L1,sPD-L1)两类。sPD-L1是具有生物学活性的mPD-L1片段,具有细胞因子效应,对于循环免疫抑制具有重要作用。mPD-L1在可以使肿瘤细胞伪装成抗原呈递细胞(Antigen presenting cells,APCs),避免被免疫杀伤,产生免疫逃逸。目前PD-L1单抗类抗肿瘤药物刚刚获得美国FDA批准上市,用于多种肿瘤治疗产生良好疗效。但是如何筛选合适的治疗对象始终未能获得满意解决,现有癌组织PD-L1免疫组化检测特异性有待提高。在胰腺癌领域,现有文献主要集中在PD-L1在胰腺癌组织的高表达及负性预后因子方面,尚未见针对胰腺癌早期转移相关的外周血sPD-L1以及循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTC)表面mPD-L1表达的相关研究。目的:1、研究胰腺癌外周血sPD-L1表达特点及临床意义;2、观察胰腺癌组织PD-L1与CD8~+T细胞分布规律,归纳各种表现,证实胰腺癌组织内PD-L1与CD8~+T细胞负反馈平衡设想;3、了解sPD-L1与癌组织PD-L1、CD8~+T细胞表达之间相互关系;4、验证胰腺癌CTC表面mPD-L1表达;5、研究手术创伤对于sPD-L1早期变化影响。【研究方法】1、外周血sPD-L1检测:选择既往无过敏史、免疫相关性疾病、肿瘤史及急性现症感染的各类初诊胰腺良恶性占位、慢性胰腺炎、健康对照组人群共计154人,其中胰腺癌85例,胰腺良性占位14例。收集术前外周血清,手术患者收集术后24小时内血清。血清采集后3个月内采用双夹心法ELISA检测sPD-L1并同时检测IFN-γ配对水平。之后采集临床数据,进行相关性分析。患者随访目前尚在进行中。2、胰腺癌组织PD-L1免疫组化:在第一部分研究对象中,依据文献PD-L1免疫组化影响相关因素,选择手术病理标本充足、病理类型为胰腺导管腺癌标本,实质间质交界部位取材,连续切片。受到经费及时间限制,依据术前sPD-L1表达情况,取符合条件的最高/最低各14名病理标本进行PD-L1、CD8~+T细胞免疫组化染色,观察拍照并评分统计。目前正在积极补充实验扩大研究样本。3、胰腺癌CTC筛选及mPD-L1表达检测:在第一部分研究对象中,收集健康人群5人、良性占位5人、无远处转移胰腺癌5人、IV期远处转移胰腺癌患者5人,共计20人份外周血标本。CTC富集:每份外周血5ml,EDTA抗凝,不取进针后第一管血,采血后6小时内采用密度梯度离心,筛选外周血单核细胞。后进行免疫磁珠负分选,筛选CTC,光镜观察拍照并涂片备用。免疫荧光:采用DAPI细胞核染色、CD45单抗排除免疫细胞、pan-CK单抗为筛选肿瘤标志物联合PD-L1单抗进行四色免疫荧光检测。CTC特征:pan-CK(+)CD45(-),DAPI染色细胞核大,如PD-L1阳性,染色(绿色)定位于细胞膜。4、结果统计分析:由于样本来源于同一患者,各部分试验结果在统计分析时会依据需要进行配对比较。【研究结果】1、sPD-L1:胰腺癌外周sPD-L1显著高于健康对照组,但低于慢性胰腺炎组;sPD-L1与肿瘤分期及远处转移显著相关;不同病理类型胰腺占位sPD-L1表达存在显著性差异;血清sPD-L1和IFN-γ水平趋势一致;sPD-L1和各类血细胞水平显著相关,和胰头肿瘤、黄疸、CA199等显著相关;无论良恶性占位,手术创伤后24小时内sPD-L1显著增加;2、胰腺癌PD-L1免疫组化(本部分结果正在扩大样本进一步验证):PD-L1阳性率为39.2%(11/28),CD8+T细胞64.3%(18/28);胰腺癌血清sPD-L1与癌组织PD-L1免疫组化阳性率无显著相关性,与CD8~+T细胞阳性率相关性一致;癌组织PD-L1与CD8~+T细胞存在负反馈调节,空间分布存在相应规律;3、胰腺癌CTC表面PD-L1表达:仅在胰腺癌远处转移患者中发现CTC,并确认胰腺癌CTC表面存在PD-L1表达,需要进一步扩大样本。【研究结论】sPD-L1在胰腺癌患者,尤其是远处转移患者中高表达,且胰腺癌CTC表面存在PD-L1表达。PD-L1在胰腺癌外周血中各种形式的异常表达,可能对于系统免疫抑制及CTC免疫逃逸存在促进作用。癌组织内的PD-L1表达可以促进CD8~+T细胞凋亡,促进TME免疫抑制环境的产生。手术创伤后机体免疫系统24小时内PD-L1表达上调,一方面保护机体免受过度自身免疫反应损伤,另一方在恶性肿瘤尤其无法R0切除的手术病例中,术后sPD-L1升高是可能的危险因素之一。全面分析外周血sPD-L1、CTC及其PD-L1表达和癌组织内PD-L1、TILs表达,有助于全面评估胰腺癌患者免疫抑制状况,胰腺癌精准治疗将从中获益。