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红曲菌(Monascus spp.)是我国及东南亚国家的传统食品发酵微生物,主要用于红曲的生产,可产生多种有益的次级代谢产物,并被广泛应用于食品、医药等行业。红曲色素(Monuscus pigments,MPs)是红曲菌产生的最主要的次级代谢产物之一,除了着色功能以外,部分MPs还具有抗氧化、消炎以及抗癌等生物学活性。自上世纪90年代中期,本实验室开始从事红曲菌的分子生物学研究,2010年完成1株红色红曲菌(Monascus ruber)M7的全基因组测序与分析,克隆得到包括16个基因(MpigA～MpigQ),大小为51Kb的MPs基因簇,通过基因敲除、回补、过表达等方法研究了部分基因的功能,但仍有数个基因(MpigF、MpigG、MpigH、MpigI、MpigP)的功能需要研究,以完善红曲色素的合成途径。本课题以MpigF和MpigP(预测相应编码蛋白分别为单胺氧化酶和未知功能蛋白)为研究对象,成功构建了相应的基因缺失突变菌株,并对基因缺失株的生长形态,显微形态及色素和桔霉素产生能力进行了分析。主要研究结果如下:1.△MpigF和△MpigP的构建从反转录PCR的分析结果可知,红色红曲菌M7中MpigF和MpigP两种基因在转录水平上都可表达,利用Double-joint PCR的方法构建两种基因的敲除盒,以pCAMBIA3300质粒为载体构建基因敲除载体,通过根癌农杆菌介导转化法将敲除载体携带的色素相关基因敲除盒整合到M7基因组中,经PCR和Southern杂交验证,获得MpigF和MpigP的敲除菌株△MpigF和△MpigP,作为后续实验的研究材料。2.△MpigF和△MpigP突变菌株生长发育及产色素与产桔霉素能力分析△MpigF在PDA(Potato dextrose agar)培养基上与野生菌株M7相比菌落颜色偏亮黄色,在 CYA(Czapek yeast extract agar)和 MA(Malt extract agar)培养基上颜色深浅也有一定的差异;△MpigP在PDA上菌落颜色比M7明显变浅,在MA培养基上呈粉红色。在PDA、CYA、G25N(Glycerol nitrate agar)和MA培养基上的显微形态观察表明:野生菌株和两种基因缺失株产生分子与子囊孢子无差异。野生菌株和两种基因缺失株在液态发酵过程中不同时期的生物量略有不同,两种基因缺失株前期生长速度稍慢于M7。3.△MpigF和△MpigP产MPs与产桔霉素能力的分析相对于M7生成的6种黄色素、2种橙色素和4种红色素,△MpigF主要产生4种黄色素为:Monasfluore A、Monasfluore B、Monascine 和 Ankaflavin。△MpigP主要产生 4 种黄色素为:Monasfluol A、Monasfluol B 以及 Monascusazaphilone C 和Acetyl-Monasfluol B。PDB 中 28℃、120r/min,培养 15 d 后,△MpigF和△MpigP的胞内外桔霉素总生成量分别是M7的0.39和0.24倍。综上所述,MpigF和MpigP对M7的生长繁殖无明显的影响,但对MPs和桔霉素的合成能力有很大影响,说明这两种基因在MPs合成途径中发挥着重要的作用。