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含patatin样磷脂酶域3(patatin-like phospholipase domain containing 3,PNPLA3)基因属于patatin样磷脂酶家族,该家族都包含patatin结构域,该结构域主要参与甘油三酯代谢和膜流动,并具有脂肪酰化水解酶活性。而PNPLA3具有磷脂酶和酰基转移酶双重功能,并参与了脂质代谢,其在调节甘油三酯代谢方面有着不可替代的作用。因为在脂肪和能量代谢方面的调控功能,PNPLA3基因被作为研究动物的肉类品质,脂肪积累及生长发育侯选基因,同时其又与肥胖和糖尿病紧密相关,成为治疗肥胖和非酒精性脂肪肝的潜在药物靶点。但是PNPLA3基因与中国黄牛生长发育的关联性,以及在黄牛肝脏脂肪中的作用机制尚不清楚,仍需进一步研究。因此,本研究以中国黄牛PNPLA3基因为研究对象,对该基因的遗传变异进行研究,以期找到对中国黄牛生长有显著影响的分子标记,同时对PNPLA3基因在秦川牛不同年龄各个组织的表达量进行分析研究,另外构建了秦川牛PNPLA3基因启动子不同截短体荧光素酶表达载体,并根据荧光素酶报告基因的活性找出启动子核心区域,为深入研究PNPLA3基因启动子对动物机体的能量代谢等方面的功能研究提供试验基础。1.黄牛PNPLA3基因遗传变异研究本研究运用混合DNA池测序与Forced RFLP-PCR(限制性片段长度多态性聚合酶链式反应)技术对秦川牛,南阳牛和郏县红牛三个中国地方黄牛品种(共660头)的PNPLA3基因进行了多态的扫描和分型,并与秦川牛的生长性状进行了关联分析。结果在这三个黄牛品种中共检测到4个错义突变,分别为g.A2980G(SNP1),g.A2996T(SNP2),g.A36718G(SNP3)和g.G36850A(SNP4)。群体遗传参数分析表明,SNP1、SNP3和SNP4属于中度多态(0.25<PIC<0.50),且4个多态位点基本都符合哈迪温伯格平衡。连锁不平衡分析发现,SNP 3和SNP 4位点间处于高度连锁状态(D’>0.7,r2>0.3);单倍型分析表明,共有4个单倍型,且单倍型2(-AAGA-)在所有黄牛品种中出现的频率最高。同时,关联分析表明,这4个SNPs与秦川牛的体重和胸围等生长性状显著相关(P<0.05)。具体说来,秦川牛SNP1位点的A1G1基因型,SNP2位点的A2A2基因型和SNP3位点的A3A3基因型个体的体重均显著高于其他个体(P<0.05),SNP1位点的A1G1基因型和SNP4位点的G4G4基因型个体的胸围也都显著优于其他个体(P<0.05)。所以,这4个多态位点可作为肉牛性状改良的分子标记,用于标记辅助选择。2.秦川牛PNPLA3基因组织表达规律研究利用qRT-PCR技术,对秦川牛PNPLA3基因进行表达规律研究,为进一步揭示牛PNPLA3基因在脂肪形成中的作用提供一些基础资料。秦川牛PNPLA3基因在3个发育阶段(胎牛、犊牛、成年牛)7个组织中的相对定量结果显示,其表达受时空特异性的影响。PNPLA3基因在同一时期各组织间差异表达,在三个时期的肝脏中其表达量均很高,在犊牛和成年牛的脂肪组织中表达丰度最高(胎牛难以采集脂肪样品),在胎牛和犊牛的脾脏中表达量也较高,而其他组织中表达量都不是很高。同时,比较秦川牛不同发育阶段同一组织的PNPLA3基因表达量,结果发现该基因的表达量受发育时期影响显著,心脏、肺脏、肾脏和肌肉中的变化尤为明显,表达量随年龄增加呈降低趋势(P<0.05)。另外,将PNPLA3 mRNA表达与SNP结合分析,结果发现SNP1位点AG表达量显著高于AA与GG(P<0.05),这与体尺性状分析相吻合,推测该位点正向调控生长性状,而SNP4位点各个基因型表达量与体尺性状相反,猜测该位点与生长性状负相关。3.秦川牛PNPLA3启动子活性区域的筛选采用基因克隆、DNA测序和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建秦川牛PNPLA3基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同截短体的pGL-3重组质粒,分别与内参对照载体pRL-TK共转染293T细胞,通过荧光素酶活性测定,确定启动子活性区域。结果表明,成功构建了启动子不同截短体的荧光素酶表达载体pGL3-Basic-P1、pGL3-Basic-P2、pGL3-Basic-P3、pGL3-Basic-P4、p GL3-Basic-P5,荧光素酶活性分析表明,启动子中段区域(P2,-1696~-1192 bp)可能存在负调控元件。