【摘 要】
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目的:探究糖尿病足患者外周血液来源的外泌体（Dia-Exos）对于人脐静脉内皮细胞功能和小鼠创面愈合的影响及其作用机制。方法:取糖尿病足患者的外周血液,采用高速离心法提取Dia-Exos;透射电镜、动态光散射、WB对Dia-Exos的形貌、大小和包膜上的标志蛋白进行鉴定。将荧光示踪的Dia-Exos与内皮细胞共培养,观察内皮细胞对Dia-Exos的吞噬作用。用CCK-8、流式细胞检测、迁移实验、q
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（No.2017YFC1103800）；
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目的:探究糖尿病足患者外周血液来源的外泌体（Dia-Exos）对于人脐静脉内皮细胞功能和小鼠创面愈合的影响及其作用机制。方法:取糖尿病足患者的外周血液,采用高速离心法提取Dia-Exos;透射电镜、动态光散射、WB对Dia-Exos的形貌、大小和包膜上的标志蛋白进行鉴定。将荧光示踪的Dia-Exos与内皮细胞共培养,观察内皮细胞对Dia-Exos的吞噬作用。用CCK-8、流式细胞检测、迁移实验、qRT-PCR、WB、成管实验观察Dia-Exos对内皮细胞功能的影响。取小鼠建立皮肤缺损模型,在创面周围注射Dia-Exos,观察创面愈合的情况;第10天使用小动物多普勒观察创面血流灌注情况;第14天使用H＆E、CD31染色分别观察创面组织和新生血管情况。接着进一步研究Dia-Exos来源miR-24-3p对于内皮细胞和创面愈合的影响,取糖尿病足患者的血液样本、Dia-Exos和Dia-Exos组小鼠14天新生皮肤组织,用qRT-PCR检测其中miR-24-3p的水平。选择AgomiR-24-3p来模拟内源性miR-24-3p,采用CCK-8、流式细胞检测、迁移实验、qRT-PCR、WB、成管实验观察miR-24-3p水平升高对内皮细胞功能的影响,接着使用AntagomiR-24-3p抑制细胞内miR-24-3p的表达,观察抑制miR-24-3p的表达是否会影响Dia-Exos对内皮细胞功能的抑制作用。取小鼠建立皮肤缺损模型,在创面周围注射AgomiR-24-3p或AntagomiR-24-3p,观察创面愈合的情况;第10天使用小动物多普勒观察创面血流灌注情况;第14天使用H＆E、CD31染色分别观察创面组织和新生血管。最后探究Dia-Exos来源的miR-24-3p影响创面愈合的作用机制,使用网络miRNA靶基因的预测网站预测miR-24-3p的潜在靶基因,用双荧光素酶实验评估靶基因与miR-24-3p的结合,qRT-PCR检测miR-24-3p的高表达对于靶基因的影响。采用si RNA敲低内皮细胞中靶基因的表达,CCK-8、流式细胞检测、迁移实验、qRTPCR、WB、成管实验观察敲低靶基因对于内皮细胞功能的影响。结果:Dia-Exos的形状均呈杯状或者球形,粒径在30~150 nm之间,WB结果显示Dia-Exos的表面存在标记蛋白TSG101和CD9。细胞实验结果显示Dia-Exos能被内皮细胞摄取,并抑制内皮细胞的增殖、迁移和成管能力,促进细胞凋亡。动物实验结果显示Dia-Exos会抑制小鼠创面的愈合,减少局部血流灌注,减少新生血管生成。qRT-PCR结果显示糖尿病足患者的血液样本、Dia-Exos和Dia-Exos组小鼠14天新生皮肤组织中的miR-24-3p水平显著升高。AgomiR-24-3p能抑制内皮细胞的增殖、迁移、成管能力,促进细胞凋亡;AntagomiR-24-3p的加入能逆转Dia-Exos对内皮细胞功能的抑制作用;体内动物实验结果显示AgomiR-24-3p会抑制小鼠创面的愈合,减少局部血流灌注,减少新生血管生成。预测网站结果显示PIK3R3可能是外泌体来源miR-24-3p影响创面愈合的潜在靶基因,双荧光素酶实验结果显示miR-24-3p能与PIK3R3密切结合,qRT-PCR结果显示高水平的miR-24-3p会抑制PIK3R3的表达,体外实验结果显示敲低PIK3R3的表达会抑制内皮细胞的功能,加入AntagomiR-24-3p会逆转这种抑制作用。结论:Dia-Exos通过抑制内皮细胞的增殖、迁移和成管能力,促进细胞凋亡,减少创面的血管生成,从而延迟创面的愈合。糖尿病足患者的血液以及Dia-Exos中miR-24-3p水平显著增高,高表达的miR-24-3p是Dia-Exos调控内皮细胞功能和小鼠创面愈合的潜在作用机制。Dia-Exos来源的miR-24-3p通过靶向作用PIK3R3延迟创面的愈合。
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