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细胞膜转运体在药物的体内处置过程中发挥了重要作用,同时也介导许多药物-药物间的相互作用。因此,转运体介导的药物相互作用越来越受到重视。二甲双胍为2型糖尿病的一线治疗药物,经口服吸收后进入肝脏细胞发挥降血糖作用,主要以原型经肾脏排泄,肾脏中二甲双胍的过度积累可引起肾损伤。研究表明,有机阳离子类转运体,如有机阳离子转运体1（OCT1）、有机阳离子转运体2（OCT2）和多药及毒素外排蛋白1（MATE1）,在肝脏、肾脏对二甲双胍的处置中发挥着重要作用,其临床疗效、毒副作用的个体差异与有机阳离子类转运体的基因多态性相关。高血脂是糖尿病的常见并发症,在老年糖尿病人群中,高血脂更是最早出现的并发症,荷叶制品作为降血脂的保健品极可能在使用二甲双胍进行糖尿病治疗期间服用。荷叶生物碱作为荷叶中降血脂的主要活性成分之一,根据荷叶生物碱的结构,推测其可能为有机阳离子类转运体的抑制剂/底物,但其是否会通过影响转运体从而影响二甲双胍的转运,进而对二甲双胍的疗效及毒性产生潜在影响尚未见报道。鉴于永生化肝、肾细胞系往往不表达或低表达转运体,原代细胞上的转运体也会随培养时间延长而丢失。因此,本文首先构建稳定表达hMATE1及共表达hOCT1/hOCT2与hMATE1的转基因细胞模型,并用于研究荷叶中生物碱对有机阳离子类转运体介导的二甲双胍摄取和转运的影响,为后续研究荷叶生物碱与二甲双胍的相互作用,及由此引起的药效/毒性的影响提供依据。1.构建 pcDNA3.1（+）-hMATE1 重组质粒首先,从人肾脏组织中提取总mRNA,经逆转录PCR和引物特异性PCR扩增hMATE1 cDNA。1%琼脂糖凝胶电泳后经胶回收纯化获得纯净的目的片段,测序后与SLC47A1 mRNA（NM018242.2）的编码区序列比对,将100%匹配的PCR产物添A连T获得pMD19-T-hMATE1,并转入大肠杆菌扩增。大量pMD19-T-hMATE1与pcDNA3.1（+）经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后重组连接获得重组质粒,再次测序验证序列正确性,以获得含正确野生型hMATE1 cDNA的pcDNA3.1（+）-hMATE1。结果显示,经过琼脂糖凝胶电泳及胶回收纯化及多次测序比对,获得含正确SLC47A1 mRNA（NM018242.2）的编码区序列全长的pcDNA3.1（+）-hMATE1。2.构建稳定表达hMATE1及共表达hOCT1/2与hMATE1的MDCK模型将pcDNA3.1（+）-hMATE1重组质粒转染MDCK和已经转染hOCT1或hOCT2的MDCK细胞,经过潮霉素B筛选获得抗性克隆。利用hMATE1依赖H+跨膜浓度差为转运驱动力的特性使其转运方向由外排转变为摄取,通过hMATE1底物4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和N-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）的积聚实验,筛选获得具有良好hMATE1功能的MDCK-hMATE1、MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型。经实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）测定细胞模型中 hMATE1 mRNA 的表达;考察MDCK-hMATE1对经典底物二甲双胍的积聚能力,以及MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1对经典底物西咪替丁的外排作用,以验证细胞模型功能。结果显示,本研究获得的三个细胞模型与阴性对照细胞相比,hMATE1 mRNA的表达量均显著增加,MDCK-hMATE1对10μmol/L二甲双胍摄取的能力为阴性对照细胞的17.6倍,且能被100μmol/L西咪替丁显著抑制;MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1对经典底物西咪替丁的外排率分别为34.0和17.5,净外排率分别为17.5和3.65,净外排率均大于2。上述结果表明,本研究构建的MDCK-hMATE1、MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞模型表达的hMATE1功能良好,可用于hOCTs/hMATE1介导的荷叶生物碱与二甲双胍的药物-药物相互作用研究。3.荷叶生物碱对hOCTs/hMATE1介导的二甲双胍转运的影响阿朴啡类生物碱是荷叶中分离出的含量最高的生物碱种类,本章研究了荷叶中4种主要的阿朴啡类生物碱,荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、N-甲基巴婆碱和巴婆碱对hOCTs及MATE1转运二甲双胍的影响。首先应用 MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3 和 MDCK-hMATE1细胞模型,考察荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、N-甲基巴婆碱和巴婆碱是否影响上述四种转运体对二甲双胍的转运,结果表明,四种生物碱均能抑制hOCT1/2/3和hMATE1对二甲双胍的转运,抑制程度均为:hOCT1>hMATE1>hOCT3>hOCT2。hOCT1和hOCT2分别为肝脏和肾脏中主要的有机阳离子转运体,hOCT3在肝、肾的表达不如前两者,hMATE1在肝、肾中均有较丰富的表达,由于所考察的四种生物碱100μmol/L时对hOCT2转运二甲双胍（10μmo1/L）的抑制程度均较低（<50%）,因此,我们仅考察了四种生物碱对hOCT1和hMATE1介导的二甲双胍转运的浓度-抑制率关系,得到荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、N-甲基巴婆碱和巴婆碱抑制hOCT1转运二甲双胍（10μmol/L）的IC50分别为13.6±1.8、14.9±1.2、6.68±0.44 和 16.6±3.1μmol/L,抑制 hMATE1 转运二甲双胍（10μmol/L）的 IC50分别为 16.9±0.47、19.0±1.5、16.4±0.54 和 21.4±0.81μmol/L。由于四种生物碱抑制hOCT1和hMATE1转运二甲双胍的IC50接近,且四种生物碱对hOCTs和hMATE1具有相同的抑制顺序,后续以荷叶碱为代表,考察其对MDCK-hOCT1/hMATE1和MDCK-hOCT2/hMATE1细胞跨细胞转运二甲双胍的影响。结果显示,荷叶碱浓度依赖性地抑制MDCK-hOCT1/hMATE1细胞由基底侧至顶侧方向转运二甲双胍,亦能浓度依赖性地降低该方向转运时细胞内二甲双胍的积聚;荷叶碱也能浓度依赖性地抑制MDCK-hOCT2/hMATE1细胞由基底侧至顶侧方向转运二甲双胍,但却增加该方向转运时细胞中二甲双胍的积聚,且在一定范围表现出浓度依赖性。上述结果表明,以荷叶碱为代表的阿朴啡类生物碱可抑制hOCT1/2/3和hMATE1对二甲双胍的转运,并可影响二甲双胍在共表达有hOCT1/2与hMATE1的细胞中的浓度。