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结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）仍然是全球最成功的致病菌之一。结核病难以治疗的症结在于结核菌的持留性、耐药性和毒力性,其中耐药性结核分枝杆菌是治疗的重难点。据世界卫生组织估计,2019年由吡嗪酰胺（Pyrazinamide）和氟喹诺酮类（Fluoroquinolone）耐药结核菌引起的新发结核病例至少为630万例,而其中多耐药病例为49万例。此外,由于多耐药（MDR）和广耐药（XDR）结核病的发病率越来越高,可用于治疗结核病的抗生素越来越少。为了更有效治愈结核病患者,必须开发新的治疗方案。结核分枝杆菌细胞壁和细胞膜是结核菌抵抗抗生素和宿主免疫杀菌的重要屏障。分枝杆菌细胞膜是一种复杂的多层结构,主要由5个重要部分组成:质膜（Plasma Membrane,PM）、肽聚糖（Peptidoglycan,PG）、阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan,AG）、外膜（Outer membrane,OM）和分枝菌酸（Mycolic Acid,MA）。细胞壁则主要由肽聚糖（PG）组成。细胞壁和细胞膜在支持细胞生长,发挥细胞毒力和逃避宿主免疫等方面至关重要。特别是细胞膜合成和组装的过程十分复杂,为开发抗结核药物提供了大量候选靶点。因此,细胞壁和细胞膜组分是新药研发值得关注的靶标来源。在本研究中我利用Tn7转座子构建了包含10000株基因突变菌株的耻垢分枝杆菌突变库,通过筛选我发现编号为M492的突变菌对吡嗪酰胺的敏感（PZA）性上升。我通过质粒拯救的方法,进一步鉴定发现M492的突变基因为MSMEG3314（膜转运蛋白）。比对发现MSMEG3314在海分枝杆菌（M.marinum）,麻风分枝杆菌（M.leprae）,耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）,牛分枝杆菌（M.bovis）,鸟分枝杆菌（M.avium）,和脓肿分枝杆菌（M.abscess）中均保守存在,其一致性均高于60%。MSMEG3314的缺失改变了细胞膜的质子浓度梯度差（pH差）,增强了氟喹诺酮类药物的杀菌效率。同时,添加活性氧（ROS）清除剂（硫脲和联吡啶）可以减弱莫西沙星的杀菌能力,证明了M492突变菌对氟喹诺酮类药物的敏感与ROS的产生有关。溴化乙锭荧光染色积累和流出实验结果表明,缺失MSMEG3314会导致细胞膜透性显著增加。然后我在M492里回补表达了MSMEG3314蛋白,经过实验验证,基因功能得到了恢复。综上所述,M.smegmatismc2155 MSMEG3314在清除ROS和维持细胞膜稳定性方面具有重要作用,并影响耻垢分枝杆菌对PZA和氟喹诺酮类抗生素的耐药性。同时,通过生物信息学预测影响细菌细胞膜和细胞壁生物功能的基因发现:结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv2224c在应对多种抗生素压力时均明显差异表达,包括异烟肼、莫西沙星、万古霉素和利福平等。然后我利用同源重组技术在耻垢分枝杆菌中敲除了该基因的同源基因MSMEG4296。敲除菌对SDS更加敏感,并且其生物膜形成能力和滑动能力有缺陷,电镜扫描也发现MSMEG4296敲除菌表面形成的脊状突起明显减少,说明MSMEG4296是影响细菌生物膜形成的重要基因。抗生素MIC实验发现敲除菌对万古霉素的敏感性增加。由于细胞壁重要组分D-Ala-D-Ala是万古霉素的靶点,因此我从大肠杆菌中纯化异源表达的结核分枝杆菌Rv2224c蛋白,并与D-Ala-D-Ala相孵育,结果发现Rv2224c蛋白可以水解D-Ala-D-Ala,从而改变耻垢分枝杆菌对万古霉素的敏感性。最后,我探索了细胞壁相关蛋白对金属离子的影响。细胞壁上有多种金属离子转运蛋白,这些蛋白对维持胞内环境稳态具有重大意义。在基因突变文库中我发现了一株对铜离子含量特别敏感的突变菌株,鉴定其突变基因为MSMEG4702,对应结核分枝杆菌同源基因为Rv0102。同样,我在耻垢分枝杆菌中主动敲除了MSMEG4702基因。MSMEG4702敲除菌在低铜离子浓度下的生长变慢,但是在高铜离子浓度下的存活能力增强,提示MSMEG4702是负责摄入外源铜离子的蛋白。铜（Cu）对宿主免疫细胞内病原体如结核分枝杆菌（Mtb）是必不可少的。Western-blot实验结果表明Rv0102蛋白定位在细菌的细胞壁上,利用胞内铜离子检测试剂盒,我发现Rv0102同源基因MSMEG4702缺失的耻垢分枝杆菌胞内铜积累较少,仅为野生型耻垢分枝杆菌的三分之一。同时,MSMEG4702缺失突变体的铁硫簇代谢相关基因表达降低,对氟喹诺酮类抗生素莫西沙星的耐药性增强,这表明铜吸收减少与铁硫簇蛋白和细胞内活性氧（ROS）的产生有关。铜在巨噬细胞的免疫应答中起关键作用。MSMEG4702缺失耻垢分枝杆菌突变体在THP-1巨噬细胞中的存活能力是野生型耻垢分枝杆菌的四倍,该缺失突变体明显抑制了巨噬细胞的凋亡。这表明Rv0102是一种被证实的铜摄取蛋白,对分枝杆菌的生存和应激反应起重要作用。本研究首次证明Mtb膜蛋白Rv0102是一种铜吸收分枝杆菌蛋白（Mycobacterium copper uptake protein A,McuA）。这与之前发现的MctB和CtpV铜离子外排蛋白共同组成了结核分枝杆菌细胞壁铜转运系统。综上所述,本文从细胞膜通透性、生物膜形成能力和胞内铜离子浓度稳态三个方面鉴定了三个抗生素耐药新基因并确定了其功能,为认识抗生素耐药新机理,新药物靶标提供了基础。