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pumilio基因最先在果蝇中得以鉴定,并以母体效应基因参与果蝇胚胎发育过程中后极轴的形成而著称,编码一种RNA结合蛋白(PUM蛋白),参与转录后调节。随后在其它物种如线虫、酵母、爪蟾、哺乳动物中陆续鉴定到其同源基因。这一家族的蛋白功能具有多样性,可联合其它蛋白通过抑制、激活、定位靶mRNA参与分化、发育、生殖等生物发生过程。家蚕是一种重要的经济模式昆虫,也是鳞翅目昆虫的典型代表,拥有丰富的品种及突变体,是开展发育研究的良好材料。对其pumilio基因的研究,有助于我们了解家蚕生殖的分子机理。本研究利用荧光定量PCR技术、Western blot、免疫组化及免疫荧光技术研究了家蚕pumilio基因在胚胎发育过程中的表达模式。同时,为了免疫组化实验的进行,我们对家蚕胚子解剖的方法进行了改进。研究的主要内容和结果如下:
1.联合使用KOH和NaC10去除卵壳,并在去壳过程中采用特殊的装置双层滤网,一次性可获得许多处于不同发育阶段的完整胚子,包括通常情况下难于获取的早期幼嫩胚子;获取的这些胚子可用于免疫组化实验。
2.对BmPUM基因进行荧光定量PCR实验表明,BmPUM的mRNA在家蚕胚胎发育的整个过程中都有转录,其中,第1天(胚带形成期)的表达量最高,随后降低,第3至第四天微有回升,第5天(性腺形成)再次大幅下降,有趣的是第6天(毛瘤发生期)表达又上升达一新高,从产卵后0h至第10天呈现两个表达峰。Western blot和免疫组化实验结果表明BmPUM的翻译水平与其转录水平基本相一致。而与pumilio相作用的nanos只在产卵后0h至第1天高表达,随后都很低。结果表明在家蚕胚胎发育的早期,BmPUM很可能与Bm-nanos有协同作用,同时在性腺的形成和毛瘤的发生过程中,BmPUM可能发挥特殊的功能。
3.亚细胞定位发现BmPUM蛋白主要存在于细胞质中,但细胞核中也有少量分布。核质分离实验与其结果相一致。这就暗示了BmPUM蛋白在家蚕胚胎发育过程中,除了翻译水平上的调控外,可能也具有牵引RNA出细胞核的功能。