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第一部分褪黑素在早发性卵巢功能不全治疗中的临床疗效及机制研究目的:探讨褪黑素(melatonin,MT)对早发性卵巢功能不全患者的临床疗效及其作用机制。方法:(1)本研究所有入选患者均为2014年6月至2016年8月于4个三甲医疗机构妇产科诊断为卵巢功能不全者,共322例。依照随机对照原则,入选患者被分为2组,分别为观察组和对照组。其中,观察组患者接受褪黑素片(1mg/天)治疗,对照组患者给予安慰剂进行治疗。(2)分别在治疗前、治疗后的1、3、6月采集患者血清,检测FSH和E2水平疗开始前的FSH和E2采血时间为患者月经2-4天;治疗开始后1月、3月、6月复查FSH和E2时,要求先行B超检查,内膜<5mm,双侧卵巢无≥10mm的卵泡方可采血。若复查时不符合以上条件,视为患者未处于性激素基础状态,无法采集治疗后FSH和E2数据,则剔除该患者的所有FSH和E2数据。治疗前1天、治疗后1月、3月、6月,对两组患者T淋巴细胞、ROS水平、VEGF水平以及血清IL-1、IL-8、INH-B、AMH进行检测;治疗前1天、治疗6个月后收集患者的晨尿,测定尿8-OHdG及8-isoPGF2α水平;在6个月的治疗期内,对两组患者的排卵情况进行监测。除FSH和E2外,其他项目检测不受月经周期的影响。对相应的结果进行统计学分析。结果:观察组和对照组女性的年龄、BMI、月经周期均无显著差异(P>0.05),表明两组患者具有可比性。经治疗后:(1)观察组患者的FSH水平较对照组明显降低(P<0.05),雌激素水平逐渐增高(P<0.05),且呈时间依赖性;(2)治疗前后患者的月经周期未有显著差异(P>0.05);(3)观察组患者的ROS、VEGF、IL-1、IL-8水平明显低于对照组(P<0.05),且呈时间依赖性;观察组患者的血清INH-B、AMH水平显著高于对照组(P<0.05),呈时间依赖性;(4)观察组患者的G1/M期淋巴细胞百分比明显低于对照组,呈时间依赖性(P<0.05);(5)治疗6个月后,观察组患者尿8-OHdG及8-isoPGF2α水平较对照组显著降低(P<0.05);(6)治疗期间,观察组出现排卵的患者数量明显多于对照组(P<0.05);(7)观察组患者血清褪黑素水平与ROS水平呈负相关(rs=-0.427,P<0.05)。结论:褪黑素对于早发性卵巢功能不全具有较好的治疗效果,该作用可能是经由抑制ROS、VEGF的生成,保护卵泡正常发育实现的。第二部分基于PI3K/AKT/mTOR自噬通路探讨褪黑素治疗早发性卵巢功能不全的机制研究目的:以PI3K/Akt/mTOR通路为切入点,通过体外细胞实验,从多层次、多角度揭示褪黑素干预POI的分子机制,为POI的临床防治提供新的依据和新的方向。方法:选取卵巢颗粒细胞COV434为研究对象,采用血清饥饿法体外诱导细胞自噬,并给予不同浓度MT进行干预,随后采用流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜观察细胞自噬体形成,western blot法检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Agt5的表达,检测PI3K/Akt/mTOR信号通路活化情况。结果:(1)细胞凋亡检测结果表明,与对照组相比,模型组和各MT浓度组细胞的凋亡率显著增高(P<0.05);与模型组相比,各MT浓度组细胞的凋亡率均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),且随着MT作用浓度的增大,COV434细胞的凋亡率逐渐降低;(2)透射电镜观察结果显示,与对照组相比,模型组和各MT浓度组经血清饥饿处理后细胞的胞浆中出现了典型的自噬体结构,其中部分细胞发生了严重损伤,导致细胞死亡;与模型组相比,各MT浓度组细胞中的自噬体明显减少,且呈剂量依赖性;(3)自噬相关蛋白检测结果表明,与对照组相比,模型组和各MT浓度组COV434细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比显著增高、Agt5蛋白的表达水平明显上调(P<0.05);与模型组相比,各MT浓度组细胞中LC3II/Ⅰ比、Agt5蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;(4)PI3K/Akt/mTOR相关蛋白检测结果显示,与对照组相比,模型组和各MT浓度组COV434细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达水平明显下调(P<0.05);与模型组相比,各MT浓度组细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。结论:MT对POI的保护作用是通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制自噬相关蛋白的表达,继而抑制卵巢颗粒细胞自噬实现的。第三部分褪黑素对POI大鼠卵巢功能保护作用的实验研究目的:本部分研究拟建立POI大鼠模型,以此作为研究对象探讨MT在体内是否能够通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥保护卵巢的作用。本研究旨在通过动物模型实验进一步验证MT保护POI的作用机制,为寻找POI治疗的新途径奠定理论和实验基础。方法:雌性SD大鼠连续给予雷公藤多甙片,建立大鼠POI模型,随后将大鼠随机分为模型组、3-MA组、RAPA组和MT组,正常雌性SD大鼠作为对照。ELISA法检测各组大鼠外周血AMH、INH-B、FSH、E2、LH、P和T的水平。HE染色观察各组大鼠卵巢组织的病理变化,计数原始卵泡、初级卵泡、窦卵泡、闭锁卵泡数量。Western blot法检测卵巢组织中p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白的表达。结果:(1)卵巢湿重和卵巢指数检测结果显示:对照组大鼠左、右卵巢湿重在所有组别中最高(P<0.05),模型组大鼠左、右卵巢湿重最低(P<0.05),RAPA组左、右卵巢湿重较模型组增加(P<0.05),3-MA组、MT组大鼠的卵巢湿重较RAPA组增加(P<0.05),3-MA组和MT组之间卵巢湿重无显著差异(P>0.05)。对照组大鼠卵巢指数在所有组别中最高(P<0.05),模型组大鼠卵巢指数最低(P<0.05),RAPA组大鼠卵巢指数较模型组升高(P<0.05),3-MA组、MT组大鼠的卵巢指数较RAPA组升高(P<0.05),3-MA组和MT组之间卵巢指数无显著差异(P>0.05)。(2)血清AMH和INH-B检测结果显示:对照组大鼠的AMH和INH-B水平在所有组别中最高,而模型组最低,RAPA组血清AMH、INH-B水平较模型组升高(P<0.05),3-MA组、MT组血清AMH、I-NH-B水平较RAPA组升高(P<0.05),3-MA组和MT组之间无明显差异(P>0.05)。(3)血清FSH、LH、E2、P和T水平检测结果显示:对照组大鼠的FSH和LH水平在所有组别中最低(P<0.05),而模型组最高(P<0.05),RAPA组血清FSH、LH水平较模型组降低(P<0.05),3-MA组、MT组血清FSH、LH水平较RAPA组降低(P<0.05),3-MA组和MT组之间无明显差异(P>0.05)。对照组大鼠E2水平在所有组别中最高(P<0.05),模型组最低(P<0.05),RAPA组大鼠血清E2水平较模型组升高(P<0.05),MT组和3-MA组的E2水平较RAPA组升高(P<0.05),3-MA组和MT组之间无明显差异(P>0.05)。各组的T和P水平差异无统计学意义(P>0.05)。(4)对照组大鼠的原始卵泡、初级卵泡和窦卵泡数量最多(P<0.05),模型组大鼠的原始卵泡、初级卵泡和窦卵泡数量最少(P<0.05),RAPA组的原始卵泡、初级卵泡和窦卵泡数量较模型组增加(P<0.05),3-MA组和MT组的原始卵泡、初级卵泡和窦卵泡数量均较RAPA组增加(P<0.05),3-MA组和MT组之间无显著差异(P>0.05);模型组大鼠闭锁卵泡数量最多(P<0.05),对照组大鼠闭锁卵泡数量最少(P<0.05),RAPA组闭锁卵泡数量较模型组减少(P<0.05),3-MA组和MT组闭锁卵泡数量较RAPA组减少(P<0.05),3-MA组和MT组之间无显著差异(P>0.05)。(5)PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白检测结果显示:对照组p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达在所有组别中最高(P<0.05),模型组最低(P<0.05),RAPA组大鼠p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平较模型组升高(P<0.05),3-MA组、MT组的p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平较RAPA组升高(P<0.05),3-MA组和MT组大鼠蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论:MT对POI大鼠卵巢具有保护作用,且该作用与3-MA的作用效果相似,是通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路、调节性激素、增加原始卵泡、初级卵泡和窦卵泡数量,减少闭锁卵泡数量实现的。