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背景与目的促甲状腺激素释放激素(thyrotrophin-releasing hormone, TRH)最初是从羊和猪的下丘脑中提取并纯化的3肽,它与垂体前叶促甲状腺激素细胞表面特异性受体(thyrotrophin-releasing hormone receptors, TRHRs)结合,刺激促甲状腺激素(TSH)的合成和分泌。在哺乳动物体内先后克隆出了针对TRH的两个受体,TRH-R1和TRH-R2,两者同属G蛋白耦联受体家族成员,在同种动物中其氨基酸序列具有50%的一致性。具有免疫活性的TRH及TRH受体不仅分布于下丘脑及其以外的中枢神经系统内,还广泛存在于外周组织中。睾丸是外周组织中为数不多的可同时表达TRH及其两个受体的器官,但TRH及其受体在睾丸内的功能尚不清楚,因而本实验的目的在于探讨TRHRs在大鼠睾丸内表达的意义。研究方法和内容1.利用蛋白质免疫印迹杂交及免疫组织化学方法对比研究出生后大鼠发育不同阶段(8,14,21,35,60和90天)睾丸中TRH-R2和TRH-R1的表达和定位,并结合图像分析技术对其表达进行半定量分析。2.采用Percoll连续密度梯度法离心法提取、纯化并原代培养成年大鼠(90天)睾丸Leydig细胞,探讨不同剂量TRH对Leydig细胞睾酮合成的影响。3.合成EDS,构建并验证EDS诱导的Leydig细胞凋亡模型;采用Western blotting、免疫组织化学以及免疫荧光双标的方法,观察在EDS处理后成年型Leydig细胞再生过程中TRH-R1和TRH-R2的表达情况。4.从出生后21d大鼠睾丸内分离、纯化Leydig祖细胞,采用BrdU掺入实验,观察不同剂量的TRH对Leydig祖细胞DNA合成的影响。结果1.Western blotting和免疫组织化学均检测到了TRH-R1和TRH-R2在大鼠睾丸出生后不同阶段的表达,定位在Leydig细胞,阳性物质位于胞浆和胞膜,同一个Leydig细胞可同时表达TRH-R1和TRH-R2。图像分析显示两者在不同阶段Leydig细胞内的表达强度有所不同,TRH-R2最大表达量为出生后35d睾丸,主要为新形成及未成熟的Leydig细胞,而TRH-R1则在成年大鼠睾丸内表达较高,主要为成熟的Leydig细胞。2.Percoll连续密度梯度离心法提取成年大鼠睾丸Leydig细胞,经3β-HSD酶细胞化学染色,纯度符合细胞学实验要求。在给予不同剂量TRH处理后,原代培养的Leydig细胞睾酮分泌受到影响,并呈剂量依赖性。相对低剂量的TRH(0.01和0.1 ng/ml)可显著抑制ALCs基础睾酮和hCG刺激下的睾酮分泌,P值小于0.01;而相对高剂量的TRH(1和10 ng/ml)却促进了hCG刺激下的睾酮分泌(P<0.05)。虽然1 ng/ml TRH组与0.1 ng/ml TRH在基础睾酮分泌上没有统计学差异,1 ng/ml TRH刺激下,ALCs睾酮水平亦有所升高。3.按照75mg/kg的剂量一次性给予大鼠腹腔注射EDS后,睾丸Leydig细胞在2 d后可全部凋亡消失,经血清睾酮测量、睾丸恒冷箱切片3β-HSD酶细胞化学染色、石蜡切片HE染色以及3β-HSD的免疫组织化学染色等证实,动物模型复制成功。一次性腹腔注射EDS后,Leydig细胞在24hr内即发生退化,2-3天后,Leydig细胞全部消失。EDS处理后14d,在间质管周区出现长梭形Leydig细胞的再生,至处理后28d新生的Leydig细胞数量增加并由管周向间质中央迁移,变为多角形。在EDS处理后的14d,Western blotting和免疫组织化学染色检测到了TRH-R1和TRH-R2在睾丸内的表达,此时对应着大鼠睾丸Leydig祖细胞的再生,经利用荧光双标进一步证实,TRH-R1和TRH-R2阳性细胞即为再生的Leydig细胞。4.采用Percoll连续密度梯度离心法从出生后14d大鼠中成功分离、纯化了Leydig祖细胞。在给予不同剂量的TRH(0.001-10 ng/ml)并向培养液中添加10μM BrdU后,PLCs的DNA合成可受到TRH的影响。在孵育12小时后,相对低剂量的TRH(0.001-0.1 ng/ml)可增加BrdU阳性标记细胞的数量和比例(从8.2%升高至11%以上),即PLCs的DNA合成增加,细胞的增殖或分化可能增多。但是相对高剂量的TRH(1 ng/ml)却不能促进PLCs的DNA合成,甚至BrdU掺入比例在10ng/ml TRH组略有下降(P=0.094)。将BrdU掺入时间延长至18和36hr,对照组和TRH处理组BrdU阳性细胞的数量和比例均增加(P<0.01),即0.1ng/ml TRH可显著促进PLCs的DNA合成。结论1.成功分离、纯化了大鼠睾丸PLCs和ALCs,可用于原代培养下细胞学实验。2.成功合成EDS,并构建EDS诱导的成年大鼠Leydig细胞凋亡-再生模型。3.TRH-R1和TRH-R2在大鼠睾丸出生后发育不同阶段以及EDS诱导的Leydig细胞凋亡模型中仅表达于Leydig细胞,即处于成年型Leydig细胞谱系不同阶段的Leydig细胞均表达TRH-R1和TRH-R2。另外,细胞培养显示,TRH能够影响成熟的ALCs睾酮合成分泌能力,以及Leydig祖细胞的DNA合成(增殖或分化)。故TRH及其受体参与了Leydig细胞谱系的发育和功能的调节。