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前言肿瘤在其发生发展过程中可分为两个阶段,当肿瘤体积小于1mm3时,主要依靠渗透获得营养,即血管前期(prevascular phase),为无血管生长期；当肿瘤体积大于1mm3时,主要依靠血管生成获得营养,即血管期(vascular phase)。从血管形成的观点来说,进展期的肿瘤应该被看作一个发育中的器官,血管形成在其过程中的作用和器官发生时同样重要。如果没有充足的血供,缺少生长所需的氧和其他营养成分,肿瘤很难长大超过2-3mm3。因此,抗血管生成在肿瘤的治疗中显得尤为重要。在血管生成过程中,血管内皮细胞的增殖取决于肿瘤微环境内促进增殖和诱导凋亡二者信号强度的对比。所以,抑制血管内皮细胞的生长和诱导血管内皮细胞凋亡能够抑制肿瘤的血管生成。基质金属蛋白酶(MMP)是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族,能够选择性消化广泛的细胞外基质和非基质蛋白,Ⅳ型胶原是细胞外基质和基底膜的主要结构蛋白,Ⅳ型胶原酶MMP-2,MMP-9是降解Ⅳ型胶原最主要的酶,在内皮血管生成的早期血管基底膜的降解中起重要作用。因此抑制MMP-2和MMP-9的活性可以有效防止血管基底膜的降解,减少肿瘤的血管形成。榄香烯(elemene)是我国自行开发研制的非细胞毒性抗肿瘤药物。它是从姜科植物温郁金(莪术)中提取的以β-榄香烯(化学名：1-甲基-1-乙烯基-2,4-二异丙基环己烷)为主要成分的榄香烯类化合物。大量研究表明,榄香烯能有效抑制多种肿瘤细胞的生长增殖。抑制肿瘤细胞核酸合成,诱导肿瘤细胞凋亡和分化是其作用机制的一个主要特点；榄香烯能增强肿瘤的免疫原性,改善和提高荷瘤机体的细胞免疫功能。此外,榄香烯还具有抗肿瘤转移、毒副作用小和不易耐药等优点,具有良好的应用前景。然而,目前关于β-榄香烯抗肿瘤血管生成的研究较少。实验方法一、细胞培养将ECV-304细胞置于含10%FBS的DMEM培养液中,在37℃,5%CO2培养箱(FORMA)中培养,用0.125%胰酶(含0.02%EDTA)消化,传代。在细胞培养及β-榄香烯干预后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态。二、Matrigel胶检测ECV-304细胞的成血管能力将ECV-304细胞接种于24孔板,每孔约1×106个,培养24小时；弃上清液,分别加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160gg/mlβ-榄香烯的培养液,以不含β-榄香烯的孔为对照组,每浓度平行4孔,继续培养24,48,72小时。将细胞用胰酶消化吹打,制成细胞悬液。将Matrigel胶涂于另一24孔板,每孔30-40μl,涂匀后孵箱内静置30分钟,待胶凝固,将细胞悬液接种于涂有Matrigel胶的24孔板内,继续培养24小时。在倒置显微镜下观察管腔形成情况,每孔随机选取5个视野计数管腔数,并取平均值。三、四唑氮蓝还原反应(MTT)检测细胞增殖将ECV-304细胞以每孔200μl细胞悬液(细胞浓度为1×104/ml)接种于96孔板中,培养24小时,吸出培养液；加入无血清培养液继续培养12小时,使细胞生长同步化；再次吸出培养液,分别加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml,160μg/mlβ-榄香烯的培养液,以不含β-榄香烯的孔为对照组,每浓度平行6孔,继续培养24,48,72小时。吸去孔内培养液,每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl,4小时后孔内形成紫色结晶,每孔加入200μl DMSO溶液终止反应,振荡混匀,使结晶充分溶解,置于酶标仪上检测光吸收值(OD),测定波长为490nm。四、碘化丙啶(PI)标记流式细胞仪检测细胞周期将ECV-304细胞接种于24孔板,每孔1×106个,培养24小时；弃上清液,分别加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/mlβ-榄香烯的培养液,以不含β-榄香烯的孔为对照组,每浓度平行4孔,继续培养24,48,72小时。将细胞用胰酶消化吹打,制成细胞悬液,转移至离心管中,1500转/min,离心10分钟,PBS清洗2次。弃上清,用4℃预冷的75%乙醇固定,4℃过夜。1500转/min，离心10分钟,PBS清洗1次,弃上清,加入终浓度为200μg/ml的RNase A,37℃孵育1小时；再加入浓度为20gg/ml的PI溶液,4℃避光染色30分钟。流式细胞仪上进行DNA含量和细胞周期分析得出细胞各周期的百分率。五、Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡细胞接种、干预和培养方法见上。β-榄香烯作用细胞24,48,72h后,弃去上液,用PBS冲洗1次。加入0.25%胰酶消化,1500r/min离心10min,收集细胞。用预冷的PBS洗2次。用250μl结合缓冲液重新悬浮细胞,并调整细胞数目为1×106。取195μl细胞悬液,先加入5μl Annexin-V/FITC,室温避光染色30分钟后,加入10μl碘化丙锭(PI)溶液,混匀后室温避光孵育30min。在反应管中加入400μl结合缓冲液,在流式细胞仪上进行分析。六、明胶酶谱实验测定ECV-304细胞中MMP-2,MMP-9的活性取对数生长期细胞,用DMEM培养基调整细胞密度为2×105/ml,接种于24孔板,培养24h后离心去上清,加入不同浓度p-榄香烯孵育24，48，72h后收取上清,再按5：1与上样缓冲液混合,上样于含0.8g/L聚丙烯酰胺凝胶中。作SDS-PAGE,初始电压为80V电泳30min,待溴酚蓝达分离胶后加至150V电泳70-80min。电泳所得凝胶依次洗脱(40分钟,两次),漂洗(20分钟,两次),孵育(37℃,48小时),用考马斯亮蓝染色4h,再脱色。凝胶图像扫描入计算机后即可对其条带进行半定量分析。七、统计学分析实验数据采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析和t检验,P<0.05有统计学意义。实验结果一、β-榄香烯对ECV-304细胞成血管能力的影响除20μg/mlβ-榄香烯作用于ECV-304细胞24小时,管腔形成数目与对照组相比无明显差异外,其余浓度β-榄香烯作用于内皮细胞24，48，72小时,均可明显减少ECV-304细胞形成管腔的数目,并呈剂量和时间依赖性。二、β-榄香烯对ECV-304细胞增殖的抑制作用MTT法检测,除20μg/mlβ-榄香烯作用24小时,对ECV-304细胞的增殖具有促进作用外,其余浓度β-榄香烯作用24,48,72小时对ECV-304细胞的增殖均有明显的抑制作用,并呈剂量和时间依赖性。三、β-榄香烯对ECV-304细胞周期的影响经流式细胞仪检测,除20μg/mlβ-榄香烯作用于ECV-304细胞24小时后,G1期细胞百分比较对照组减少,其余浓度β-榄香烯作用于内皮细胞24，48，72小时后,G1期细胞明显增多,而G2期和S期细胞减少,出现了G1期阻滞,并呈剂量和时间依赖性。四、β-榄香烯对ECV-304细胞凋亡的影响经Annexin V/PI双染流式细胞仪检测,浓度为40μg/ml，80μg/ml，160μg/ml的β-榄香烯作用于ECV-304细胞24,48,72小时后,细胞凋亡百分比明显增高,呈剂量和时间依赖性。五、β-榄香烯对ECV-304细胞中MMP-2，MMP-9活性的影响明胶酶谱实验显示,β-榄香烯浓度为80μg/ml及160μg/ml作用于ECV-304细胞24，48，72小时后,MMP-2和MMP-9的活性较对照组减弱,而浓度为20μg/ml及40μg/ml的β-榄香烯作用24小时,MMP-2和MMP-9的活性与对照组相比并无明显差异。结论1、β-榄香烯可以抑制体外培养血管内皮细胞的成血管能力,使血管内皮细胞在Matrigel胶中形成的管腔数目减少。2、β-榄香烯可抑制体外培养血管内皮细胞增殖,使血管内皮细胞发生G1期阻滞,并且凋亡增多。3、β-榄香烯能够抑制体外培养血管内皮细胞中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性。