背景依鲁替尼是一种新型的口服布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂,近期由美国食品和药物管理局(FDA)批准上市的治疗慢性淋巴细胞性白血病白血病(CLL),复发和难治性套细胞淋巴瘤(MCL)和Waldenstrom巨球蛋白血症(WM)的有效药物。在接受治疗的患者中观察到房颤(AF)和出血发生率增加。在CLL最初的三项大型随机研究中,依鲁替尼出现心房颤动的发生率为5-7.7%。最近公布的数据汇总分析发现,依罗替尼的房颤风险比已发表研究中的比较组高约四倍。研究发现房颤的发生和维持与多发子波折返、局灶触发驱动、心房组织重构、电重构以及神经体液因子的变化有关,是多种机制共同作用的结果。其中最为根本的因素是心房的电重构及组织重构,即心房肌细胞的电生理特性及相关蛋白质发生了变化,但是其具体的发生机制仍未完全阐明,需要进一步研究。稳心颗粒主要由党参、黄精、三七、琥珀和甘松等五味中药组成,是首个国家批准的抗心律失常中成药。大量研究表明,稳心颗粒兼有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ类抗心律失常药物的作用,对多种离子通道均有调节作用,且无明显的毒副作用,现已在临床上被广泛应用于各种类型的房颤患者的治疗。基于此,本研究将通过食道Burst刺激建立房颤的模型,研究稳心颗粒对依鲁替尼诱发房颤小鼠心房电生理及分子调控机制的影响。方法1采用经食道Burst刺激检测小鼠诱发小鼠房颤持续的时间,超声心动图法检测小鼠心功能的各项指标,心肌组织染色方法(HE染色、Masson染色和天狼星红染色)观察组织纤维化程度,以及透射电子显微镜观察心房肌细胞的超微结构的变化。2采用激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+释放、Fura-4荧光染料染色和MitoSOXRed染色,观察稳心颗粒治疗依鲁替尼诱发房颤的小鼠心房肌细胞钙火花、钙瞬变和线粒体活性氧簇生成的变化。3采用蛋白质组学技术检测稳心颗粒对依鲁替尼诱发房颤的心房肌蛋白质表达情况,主要使用双向凝胶电泳技术对细胞的蛋白质进行高通量地分离和纯化,再用专业计算机软件进行图像分析,然后通过质谱技术及蛋白质数据信息处理技术,对凝胶上的蛋白质点进行分析与鉴定,进而观察依鲁替尼诱发房颤小鼠心房肌的蛋白质组的变化。4采用蛋白印迹法(Westernblotting)分子生物学方法验证,选取氧化应激相关信号通路N0X2和N0X4作为研究对象,研究稳心颗粒对房颤小鼠心房肌氧化应激相关信号通路的影响,并进一步分析其治疗房颤的分子机制。结果1在体动物采用经食道电极Burst刺激,结果显示:稳心颗粒能够减少依鲁替尼诱发小鼠房颤转为窦性心律的时间。从整体心脏形态,心脏水平横切面组织学检查,透射电镜技术观察研究细胞超微结构,以及超声心动图测量心功能各项指标来看,小鼠房颤模型造模成功,心肌组织略有纤维化,心肌超微结构中线粒体嵴稍有改变,稳心颗粒治疗后程度均有所改善。2依鲁替尼诱发房颤小鼠的心房肌细胞钙浓度瞬时升高,钙瞬变增加;同时稳心颗粒也能够减少依鲁替尼诱发房颤的小鼠心房肌细胞钙瞬变和钙火花的发生。稳心颗粒通过调节心房肌细胞内钙离子浓度,减少房颤心律失常的发生。3 iTRAQ的定量蛋白质组方法分析,只进行了依鲁替尼诱发房颤治疗差异蛋白的初步筛查,结果显示,与心血管疾病可能相关的蛋白,如Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1,Glycerol-3-phosphate dehydrogenase[NAD(+)],以及 Deoxyguanosine kinase,mitochondrial 等。4依鲁替尼诱发房颤心房肌氧化应激相关信号通路中的Glycerol-3-phosphate dehydrogenase[NAD(+)]蛋白NADPH的两个亚基N0X2和N0X4表达增加,稳心颗粒治疗后有改善蛋白表达的趋势。需要进行重点蛋白及通路的详细的验证和评价,仍需我们在以后的研究中进一步完善。结论综上所述,在体动物的房颤病理条件下,稳心颗粒能够抑制和延缓心肌组织重构和电重构的发生发展,调控细胞内钙离子紊乱,对房颤有一定的改善作用。通过蛋白组对依鲁替尼诱发房颤治疗差异蛋白的初步筛查后,选择Glycerol-3-phosphate dehydrogenase[NAD(+)]中的两个亚基N0X2和N0X4进行验证。研究也初步探讨了稳心颗粒发挥作用的分子机制,通过降低N0X2和N0X4氧化应激相关蛋白表达的趋势,可能起到调节心律的作用。需要进一步采用G0功能注释和KEGG通路进行筛选差异蛋白,有助于了解这些蛋白可能参与的代谢或分子信号通路,来探索稳心颗粒治疗房颤的信号通路以及相关蛋白表达的影响。通过这一过程可能对下一步实验设计的合理性提供依据。