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猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)是一种嗜神经性β冠状病毒,主要感染哺乳期仔猪,诱发脑脊髓炎和/或呕吐消耗性疾病,致死率高达20%~100%。研究发现,PHEV经呼吸道感染宿主后,由嗅神经或三叉神经传播至中枢神经系统,神经细胞是其复制增殖的主要场所,但PHEV感染神经细胞的机制还有待于深入阐明。冠状病毒纤突糖蛋白(S蛋白)与细胞表面受体的结合是病毒侵染细胞的第一步,且受体类型(包括蛋白类受体和糖类受体)决定了病毒的组织嗜性,但目前对于PHEV入侵神经细胞所依赖的受体类型及结合机制尚不明确。因此,本研究基于PHEV感染的小鼠神经瘤母细胞(N2a细胞)模型,鉴定PHEV S蛋白的细胞受体类型并进一步阐明二者相互结合的分子机制。首先,本研究探讨了神经细胞表面的糖类受体是否参与PHEV的侵染过程。分别利用神经氨酸苷酶、肝素酶等外源生物酶切割细胞表面的神经氨酸(SA)和硫酸乙酰肝素(HS)两种糖链,接种病毒后进行IFA、q RT-PCR检测,结果发现去除靶细胞表面SA和HS糖链可有效抑制PHEV感染水平。将PHEV与N-乙酰神经氨酸共孵育后感染N2a细胞,FCM、Western blot和q RT-PCR检测,发现可溶性SA可特异性抑制PHEV附着靶细胞。利用甘露糖、葡萄糖、半乳糖等糖类分子或可溶性糖胺聚糖预处理病毒粒子,进行竞争性结合试验,结果发现可溶性单糖及糖胺聚糖均不影响PHEV对N2a细胞的吸附能力。上述结果证明,SA和HS是参与PHEV感染N2a细胞的重要糖类受体。硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)是一类具有HS的蛋白聚糖,广泛分布于细胞表面。为了探讨神经细胞表面的HSPG是否参与PHEV侵染过程,在N2a细胞接种病毒24 h、48 h和72 h后,利用q RT-PCR检测HSPG(包括多配体蛋白聚糖SDC和磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC)和细胞内HPSE蛋白表达水平,发现接毒后SDC3、SDC4和HPSE表达量显著升高,SDC1蛋白和m RNA表达量明显降低。利用RNAi技术敲低N2a细胞内SDC1蛋白表达,接种病毒后进行IFA、Western blot、q RT-PCR检测,结果发现SDC1蛋白表达量降低后可有效抑制PHEV感染水平,证明SDC1参与PHEV对N2a细胞的感染。通过miRNA mimic和inhibitor转染以及双荧光素酶实验证明miR-10a-5p能够特异性的靶向SDC1m RNA 3’UTR基因序列并调控SDC1表达。上述结果证明,SDC1、SDC3、SDC4是参与PHEV感染N2a细胞的蛋白多糖,其中SDC1表达受N2a细胞内miR-10a-5p的调控。其次,本研究探讨神经细胞表面的蛋白类受体是否参与PHEV入侵过程。通过PHEV在不同细胞系上连续3代培养,利用IFA、Western blot检测发现PHEV能够有效感染N2a和HT-22这两种神经细胞,以及PK-15、IPI-2I、PEF和RAW264.7四种非神经细胞。提取N2a感染后的细胞膜蛋白,利用液相色谱串联质谱技术获得PHEV感染后表达量呈差异变化的蛋白,结合已知冠状病毒受体功能分析,获得包括CD81、Ezrin、APN、CEACAM1、ACE2、DPP4等在内的PHEV潜在候选受体蛋白。分别将p FUSE-PHEV-S1-Fc、p FUSE-PHEV-S1-523-Fc与APN、DPP4、APN、ACE2、CD81等受体蛋白表达质粒共转染293T细胞,利用免疫共沉淀(Co-IP)、IFA检测,发现DPP4蛋白能够特异性结合PHEV S1和PHEV S1-523截断体蛋白。利用cas9基因编辑系统和RNAi技术敲除或敲低N2a细胞内DPP4蛋白,接种病毒后进行Western blot、q RT-PCR检测,结果发现DPP4蛋白表达被抑制后可有效抑制PHEV感染水平,同时在N2a细胞内转染DPP4过表达载体,接种病毒后进行q RT-PCR检测,发现过表达DPP4蛋白促进PHEV复制增殖,证明PHEV对N2a细胞的感染效率与DPP4蛋白表达量具有正相关性。上述结果证明DPP4蛋白为PHEV的功能性受体。最后,为了明确PHEV S蛋白与DPP4蛋白结合机制,利用生物酶活性抑制剂Vildagliptin处理N2a细胞,接种病毒后进行q RT-PCR检测,结果发现DPP4蛋白酶活性不影响PHEV复制增殖。将p FUSE-PHEV-S1-523-Fc分别与DPP4突变体蛋白表达质粒共转染293T细胞,利用Co-IP实验,证明DPP4 A288、R289以及糖基化位点N223为受体蛋白与PHEV S蛋白结合平面的关键氨基酸位点。综上所述,本研究成功鉴定PHEV入侵神经细胞所依赖的受体分子,包括糖类辅助受体HS、SA和蛋白类功能受体DPP4,并进一步证明PHEV S蛋白RBD与DPP4结合平面的关键氨基酸位点为A288、R289以及糖基化位点N223。上述研究结果,系统阐明了PHEV与神经细胞受体的识别与结合机制,为全面认识PHEV生命周期及组织嗜性提供了理论参考,也为冠状病毒受体阻断药物的开发及疫苗设计提供线索。