【摘 要】
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天麻（Gastrodia elata）是一种传统的中草药,可以治疗很多神经系统和心血管方面的疾病,如抗惊厥眩晕、镇痛、提高记忆、治疗老年痴呆等。天麻以前主要依赖于野生资源,20世纪60年代开始有人工栽培天麻技术,但是产量仍然很低。因此人们需要对天麻的生长历程有更深入的了解以提高天麻栽培生产技术。天麻素是天麻的主要活性物质,获取天麻素的主要方式有植物提取,化学合成和生物合成。植物提取法存在原材料不足
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天麻（Gastrodia elata）是一种传统的中草药,可以治疗很多神经系统和心血管方面的疾病,如抗惊厥眩晕、镇痛、提高记忆、治疗老年痴呆等。天麻以前主要依赖于野生资源,20世纪60年代开始有人工栽培天麻技术,但是产量仍然很低。因此人们需要对天麻的生长历程有更深入的了解以提高天麻栽培生产技术。天麻素是天麻的主要活性物质,获取天麻素的主要方式有植物提取,化学合成和生物合成。植物提取法存在原材料不足,提取效率低等问题,化学合成存在环境污染问题,生物合成法是近几年研究比较热门的方法。它安全高效,是合成天麻素的理想方法。葡糖基转移酶（UGT）是植物中的一类重要酶系,它可以维持和调节植物激素平衡,参与植物的防御反应和物的脱毒反应,它更是植物次生代谢产物如类黄酮,人参皂苷的关键酶。该酶在天麻素的合成过程中可将4-羟苯基甲醇转化为天麻素。本论文通过转录组分析研究白头麻和蜜环菌共生与剑麻间的生长代谢特征。从转录组数据中筛选高表达UGT酶,进行其克隆和功能鉴定。获得如下主要研究结果:1对箭麻和蜜环菌与白头麻共生天麻进行转录组测序,箭麻和共生天麻分别获得4.23Gb和9.90Gb有效数据。根据DEGs的GO分类,KEGG功能分析和KOG功能注释筛选出箭麻和共生天麻生长代谢过程中的13个关键差异酶基因,qRT-PCR分析结果与转录组数据结果基本一致。在差异表达的基因中,筛选到与天麻氮、碳和能量代谢相关基因,合成氮和碳营养物质的差异基因成上调表达,分解氮碳营养物质的差异基因呈下调表达,能量相关的差异基因大多数呈上调表达。2从天麻转录组中筛选出葡糖基转移酶基因（UGT）并找到其CDS序列,通过巢式PCR扩出其全长序列。通过RACE-PCR技术克隆获得该基因全长1764 bp,能编码588个氨基酸。组成UGT蛋白的氨基酸中脯氨酸Pro含量最高,为9.0%。无规卷曲（Random coil）结构为该蛋白质二级结构的骨架。同时构建了UGT的原核表达载体pGEX4T-UGT,诱导蛋白表达最佳条件是诱导剂IPTG浓度为0.5m M,诱导时间为6h,诱导温度为28℃。对重组蛋白进行酶学特性分析发现,该酶的最适温度为50℃,最适的p H值为6,金属离子Fe2+对该酶的活性具有抑制作用,K+和Na+能够促进UGT活性,Ca2+,Cu2+,Mg2+,Zn2+四种离子对UGT的活性影响较小。3克隆出UGT基因全长,构建真核表达载体pk7WGC2.0-355-UGT。通过在洋葱内表皮细胞瞬时表达,激光共聚焦观察到pk7WGC2.0-355-UGT在细胞核表达,定位于细胞核。构建了pH2GW7.0-35S-UGT真核表达载体,培养出蜜环菌单核菌丝,通过农杆菌转化法将UGT基因转入到单核蜜环菌中,获到具有阳性克隆的转UGT基因蜜环菌工程菌株。该菌株能够成功催化4-羟基苯甲醇转化为天麻素。
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