【摘 要】
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β-酪蛋白作为牛乳中重要的组成成分之一,有较高的营养价值。由于氨基酸序列不同,使得β-酪蛋白存在多种变体形式,目前最常见的变体形式是A1和A2型。只含A2型β-酪蛋白的牛奶,通常被称为A2牛奶,而其他的牛奶被称为A1牛奶,主要含有A1型β-酪蛋白。A1和A2型变体在第67位单一氨基酸存在差异,造成蛋白质结构和消化特性不同,因此其功能特性自然也有差别。同时,β-酪蛋白作为母乳酪蛋白的主要成分,其具备
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β-酪蛋白作为牛乳中重要的组成成分之一,有较高的营养价值。由于氨基酸序列不同,使得β-酪蛋白存在多种变体形式,目前最常见的变体形式是A1和A2型。只含A2型β-酪蛋白的牛奶,通常被称为A2牛奶,而其他的牛奶被称为A1牛奶,主要含有A1型β-酪蛋白。A1和A2型变体在第67位单一氨基酸存在差异,造成蛋白质结构和消化特性不同,因此其功能特性自然也有差别。同时,β-酪蛋白作为母乳酪蛋白的主要成分,其具备的理化性质、消化特性和免疫调节功能,是研究的重要内容,而A1和A2型β-酪蛋白之间是否对健康产生不同影响尚存在一定争议,缺乏足够的证据。因此,研究A1和A2型β-酪蛋白结构特性及其对机体健康的影响为乳制品及功能性食品提供重要的理论依据。在本研究中,首先对A1和A2牛奶中的β-酪蛋白进行提取、纯化和鉴定,以确定A1和A2型β-酪蛋白浓度和纯度。其次,构建体外消化体系比较分析A1和A2型β-酪蛋白消化产物特性和体外免疫细胞活性,最终,通过构建环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）诱导的免疫抑制小鼠模型,探究A2型β-酪蛋白对小鼠免疫活性和肠道健康的调节作用。本研究为A2型β-酪蛋白乳制品消化特性和免疫耐受性研究提供一定的理论基础。主要研究结果如下:（1）分离出高浓度和纯度的β-酪蛋白:通过等电点沉淀法分别从A1牛奶和A2牛奶中分离酪蛋白,利用阴离子交换色谱和聚丙烯酰氨凝胶电泳方法纯化和鉴定β-酪蛋白。结果表明,A1和A2型β-酪蛋白的浓度分别是0.58 mg/m L和0.64 mg/m L,纯度分别为92.45%和94.21%。（2）A2型β-酪蛋白可能更有助于胃肠道消化吸收:构建体外消化体系,将A1和A2型β-酪蛋白与人工模拟消化液共孵育。结果表明,A2型β-酪蛋白体外消化率逐渐上升,在4.0h时已达到94%,而A1型β-酪蛋白5.0 h时才达93.47%。A2型β-酪蛋白粒径分布主要集中在200-800 nm之间,且随着胃肠消化时间增加,蛋白粒径逐渐降低,在肠消化阶段蛋白大颗粒逐渐分解为＜100 nm的纳米级物质,而A1型β-酪蛋白粒径仍集中在100-500 nm较大范围。游离氨基酸、水解度和蛋白质的二级结构结果显示,随酶解的进行,必需氨基酸的含量逐渐增加,在进入肠消化阶段水解度迅速上升,且α-螺旋、β-折叠结构含量降低,无序结构增多。上述结果说明A2型β-酪蛋白较A1型β-酪蛋白可能更有助于人体胃肠道消化吸收。（3）A2型β-酪蛋白能够显著调节体外免疫细胞活性:利用CCK-8法和中性红法评估β-酪蛋白消化物对小鼠脾淋巴细胞增殖、小鼠巨噬细胞吞噬以及NK细胞活性的影响作用。结果表明,A2型β-酪蛋白消化物可促进脾淋巴细胞增殖,显著提高巨噬细胞吞噬指数和NK细胞活性,而A1型β-酪蛋白消化物表现出较弱的免疫调节作用。同时,β-酪蛋白消化物对脾淋巴细胞和巨噬细胞的4个免疫因子m RNA表达情况的结果显示,两种β-酪蛋白消化物可以提高免疫细胞因子IL-6、IL-17A和TNF-αm RNA的表达水平,降低IL-10 m RNA的表达水平,且A2型β-酪蛋白消化物的调节作用强于A1型β-酪蛋白。因此,基于消化特性和体外免疫活性研究结果,选择A2型β-酪蛋白做后续免疫功能研究。（4）A2型β-酪蛋白可提高免疫抑制小鼠机体免疫功能:构建CTX诱导的免疫抑制小鼠模型,经不同剂量的A2型β-酪蛋白饮食干预,结果表明A2型β-酪蛋白可以提高免疫器官指数,增强免疫细胞功能,减轻脾脏组织病理学损伤,显著增强血清中细胞因子IL-17A、TNF-α、IFN-γ的产生,降低IL-4产生,显著增加小鼠血清中免疫球蛋白Ig G、Ig M和Ig A含量,血清生化各指标数值趋于健康值,明显改善小鼠生理状况。整体上A2型β-酪蛋白比A1型β-酪蛋白表现出更高的免疫提升效率。同时,A2型β-酪蛋白能够通过调节肠道中有益菌和有害菌的相对丰度,改善免疫抑制小鼠肠道菌群紊乱,并显著增加乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸的含量,促进肠道微生态的平衡。
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