目的：　　通过高通量测序以及生物信息学的方法鉴定阴沟肠杆菌基因组数据中β-内酰胺类耐药基因的分布情况。筛选出所选耐药基因并研究其耐药性，接合转移实验探讨基因定位，推测其传播机制。　　方法：　　1、本课题以2009年到2011年从温州医科大学附属第一医院临床分离得到的238株革兰氏阴性杆菌菌阴沟肠杆菌作为本实验的测序菌株。每株细菌经过单独培养，混合后采用SDS法提取混合细菌基因组DNA，送到中科院北京基因组研究所进行solexa测序。　　2、通过利用生物信息学工具，将测序数据与从NCBI的GenBank数据库中收集的β-内酰胺类耐药基因序列进行比对分析，找出测序数据中包含的β-内酰胺类耐药基因的类型以及丰度的差异。为进一步实验做出预测及理论上的依据。　　3、选取鉴定到的β-内酰胺类耐药基因中报道较少的blaVEB，blaZ，blaMIR，blaKLUC，blaAZECL-29为代表，设计特异性引物，以2008年到2012年从温州医科大学附属第一医院临床得到的212株阴沟肠杆菌基因组DNA为模板，PCR反应筛选出含有目的基因的菌株，并对目的基因进行测序，确定其基因型。　　4、将全部目的基因分别连接至表达载体pET-28a上，再转化到工程菌大肠杆菌BL21中，然后通过琼脂稀释法来测定阳性克隆株对多种β-内酰胺类抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)，通过与阴性对照菌的MIC值比较来判断其耐药功能。　　5、通过接合转移实验来探究耐药基因是否编码于可接合转移质粒，并推测其传播机制。　　结果：　　1、阴沟肠杆菌基因组经测序产生294，298，898对solexa reads，利用生物信息学技术我们在阴沟肠杆菌的基因组数据当中共鉴定到14种β-内酰胺类耐药基因，它们分别是blaVEB，blaZ，blaDHA，blaSHV，blaiR，blaTEM，blaOXA，blaCTX-M-9，blaSFO,ampH,blaCTX-M-1,blaKLUC,blaACT,blaAZECL-29。　　2、选取相对稀有β-内酰胺类耐药基因blaVEB，blaZ，blaMIR，blaKLUC，blaAZECL-29设计特异性引物，以阴沟杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增反应筛选出1株阴沟肠杆菌基因组携带blaVEB基因，2株携带blaZ基因，6株携带blaMIR基因，2株携带blaAZECL-29基因，其中blaVEB基因与数据库中的blaVEB-3基因亚型相似性为100％，blaMIR及blaAZECL-29与数据库中最为接近的基因型都具有99％以上的相似性。　　3、耐药基因blaVEB(Y412)对氨苄西林、头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻利、头孢唑林等药物表现出了显著耐药性的提升，耐药浓度分别提升了7、8、7、4、3个梯度，耐药基因blaZ(CG3)、blaZ(CG4)只表现出对氨苄西林的耐药性的提升，耐药浓度提升了3个梯度。不同亚型的blaMIR基因耐药功能基本一致，同时表现出了对氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢米诺、头孢唑林、头孢西丁、头孢曲松、氨曲南、哌拉西林、派拉西林他唑巴坦的耐药性的提升，耐药浓度分别提升了8、6、8、6、5、7、4、9、6、4、4个梯度。两种亚型的耐药基因blaAZECL-29(Y411)、blaAZECL-29(CG90)的耐药性基本相同，同时表现出了氨苄西林、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢米诺、头孢唑林、头孢西丁、头孢曲松、哌拉西林、派拉西林他唑巴坦的耐药性的提升，耐药浓度分别提高了6、5、4、4、7、3、8、4、3个梯度。　　4、接合转移实验得1株成功接合子Y412/EC600，提取供体菌及接合子质粒质粒，电泳结果表明供体菌Y412中大小约为20-50kb的质粒经细菌接合转移进入了受体菌EC600。结合PCR扩增实验表明blaVEB未位于接合子质粒中，其余阳性细菌皆为接合转移实验阴性，药物敏感实验中接合子表现出了对氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢噻利、头孢唑林、头孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦、亚胺培南西司他丁等多种β内酰胺类抗生素显著的耐药性的提升，耐药浓度分别提高了10、6、7、8、8、8、11、12、6、6、4个梯度。　　结论：　　1、方法学上表明，高通量测序技术与生物信息学方法的结合，可以使我们在短时间内获得上百株细菌的基因组序列，探索基因组序列结构与病原微生物的耐药性关系，对于致病菌中耐药基因的分布和新基因的发掘及功能研究起着及其有效的作用;生物信息学的预测分析对实验操作具有强烈的指导作用，然而信息学的结论同时也需要对应的实验结果来验证。　　2、从温州医科大学附属第一医院分离的阴沟肠杆菌中预测并成功筛选得到1株携带blaVEB基因、2株携带blaZ基因、6株携带blaMIR基因、2株携带blaAZECL-29基因。　　3、耐药基因blaVEB对半合成广谱青霉素氨苄西林、一代头孢头孢唑林、三代头孢头孢他啶、头孢哌酮、四代头孢头孢噻利等药物表现出了显著耐药性的提升，耐药浓度分别提升了7、3、8、7、4个梯度，由此可见β内酰胺类耐药基因blaVEB具有多种β内酰胺类抗生素的耐药性。其中对半合成广谱青霉素氨苄西林、三代头孢头孢他啶、头孢哌酮耐药性的提高尤为明显，耐药梯度分别提高了7、8、7个梯度。耐药基因blaZ只表现出对半合成广谱青霉素氨苄西林的耐药性的提升，耐药浓度提升了3个梯度。不同亚型的blaiR基因耐药功能基本一致，同时表现出了对半合成广谱青霉素氨苄西林、哌拉西林、半合成的广谱青霉素/β内酰胺酶抑制剂派拉西林他唑巴坦、头霉素类头孢米诺、头孢西丁、单环类氨曲南、一代头孢头孢唑林、三代头孢头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松的耐药性的提升，耐药浓度分别提升了8、4、4、5、4、6、7、6、8、6、9个梯度。由此可见β内酰胺类耐药基因blaiR具有广泛的β内酰胺类抗生素的耐药性。其中对半合成广谱青霉素氨苄西林及头孢类抗生素一代头孢头孢唑林、三代头孢头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松的耐药性提升尤为明显，耐药浓度分别提升了8、7、6、8、6、9个梯度。两种亚型的耐药基因blaAZECL-29的耐药性基本相同，同时表现出了半合成广谱青霉素氨苄西林、哌拉西林、半合成的广谱青霉素/β内酰胺酶抑制剂派拉西林他唑巴坦、头霉素类头孢米诺、头孢西丁、一代头孢头孢唑林、三代头孢头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松的耐药性的提升，耐药浓度分别提高了6、4、3、4、3、7、5、4、8个梯度。由此可见β内酰胺类耐药基因blaAZECL-29具有广泛的β内酰胺类抗生素的耐药性。其中对三代头孢头孢曲松的耐药性提升尤为明显，耐药浓度提高了8个梯度。　　将不同基因耐药浓度的提升情况进行对比可以发现，其中blaMIR基因与blaAZECL-29基因耐药浓度提升情况非常相似，除了blaMIR基因单独表现出的头孢他定和氨曲南耐药浓度的提升之外，两基因均表现出了对半合成广谱青霉素氨苄西林、哌拉西林、半合成的广谱青霉素/β内酰胺酶抑制剂派拉西林他唑巴坦、头霉素类头孢米诺、头孢西丁、一代头孢头孢唑林、三代头孢头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松耐药浓度的提升，耐药浓度提升的梯度也较为相似，且blaiR基因耐药浓度提升的梯度均略大于或等于blaAZECL-29基因耐药浓度提升的梯度。　　blaMIR及blaAZECL-29基因编码的氨基酸序列长度相等，且具有95％(361/381)的相似性，对比耐药浓度提升梯度分析结果可知，两条氨基酸序列中不同的位点，都可能是blaMIR基因表现出头孢他啶和氨曲南耐药性的关键位点。而这些位点的改变也使得blaMIR基因对其他β内酰胺类抗生素耐药的实现产生了一定的影响。　　4、接合转移实验得1株成功接合子Y412/EC600，提取供体菌及接合子质粒质粒，电泳结果表明供体菌Y412中大小约为20-50kb的质粒经细菌接合转移进入了受体菌EC600。接合子菌落PCR结果表明耐药基因blaVEB不位于接合子质粒中，药物敏感实验结果表明该接合子具有多种β-内酰胺类抗菌药物抗性，说明接合子质粒上含有一个或多个β内酰胺类耐药基因，而该质粒又可以通过接合转移的方式在细菌之间来回传播，其序列及功能的进一步探究将对越来越为严重的细菌耐药问题的控制具有重大的意义。