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目的和意义研究发现一定条件的工频磁场(power frequency electromagnetic field,PF-MF)暴露对神经损伤修复存在积极作用。流行病学调查显示PF-MF与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发生存在关联,但相关的动物实验极为罕见,且尚无合理机制能够解释这一关联。本研究将从整体、组织、细胞、蛋白水平了解PF-MF暴露对AD发生的影响,并通过分子生物学研究探讨其机制,藉此进一步阐明PF-MF神经生物学效应,并为AD的防治提供新思路。材料与方法(1)PF-MF暴露联合AD大鼠模型建立:二级雄性Wistar大鼠(200±20g)96只,随机分为:对照组(C)、PF-MF暴露组(MF)、AD模型组(AD)、PF-MF暴露联合AD模型组(AD+MF)。MF组和AD+MF组采用50Hz-400μT的PF-MF持续暴露60d,C组和AD组在伪暴露装置中饲养60d;AD组和AD+MF组动物在饲养期间第1~42d腹腔注射D-gal,第43d双侧海马立体定位微量注射方法Aβ25–35。C组和MF组动物以等体积生理盐水替代D-gal和Aβ25–35,其余处理同上所述。(2)于暴露终止后6h、7d、14d、28d,采用Morris水迷宫(Morris water mazz,MWM)检测检测动物学习记忆能力改变;采用光镜、电镜检测海马组织形态和超微结构改变;采用RIA方法检测海马及脑脊液AD标志物Tau、Aβ1-42表达改变。(3)于暴露终止后6h采用蛋白质组学方法检测海马蛋白表达谱改变,筛选PF-MF暴露差异敏感蛋白,并采用WB方法检测6h、7d、14d、28d大鼠海马PF-MF暴露差异敏感蛋白SNAP25、UCHL1、EFHD2、MBP表达改变(4)于暴露终止后6h、7d、14d、28d采用WB方法检测RKIP及NF-κB通路相关信号分子p-NF-κB、p-IKK、TAK1表达改变;采用Co-IP方法,检测RKIP/TAK1相互作用改变。(5)PF-MF暴露联合AD细胞模型建立:PC12细胞经NGF诱导分化后,随机分为:对照组(C)、PF-MF暴露组(MF)、AD模型组(AD)、PF-MF暴露联合AD模型组(AD+MF)。MF组和AD+MF组以50 Hz-100μT的PF-MF暴露24h,C组和AD组在伪暴露装置内培养24小时。期间在AD组及AD+MF组培养液中加入Aβ25-35。(6)于暴露终止后3h、6h、12h,采用光镜、电镜观察细胞形态结构改变;采用MTT法检测细胞增殖活力改变;采用AO/EB及流式细胞术检测细胞凋亡改变;采用Elisa方法检测凋亡通路相关因子Fas、TNFR1、Bax、Bcl-2、Cyt C、Caspase8、Caspase3表达改变。结果(1)大鼠体重改变:6h~28d各组大鼠体重均呈增长趋势,但MF组及AD+MF组体重增长较C组及AD组显著延缓(P<0.01)。(2)大鼠学习记忆能力改变:6h~28d各组大鼠平均逃避潜伏期(average escape latenc,AEL)均呈缩短趋势;其中,AD组较C组持续性延长(6h P<0.05、7d~28d P<0.01);MF组呈类似趋势,但其延长程度较AD组为轻,并于28d接近C组水平;但AD+MF组较AD组呈缩短趋势,并于28d具显著性差异(P<0.05)。(3)大鼠海马病理学改变:6h各实验组均可见海马神经元不同程度损伤病变:胞体变小、尼氏体含量减少、核形不整、染色质浓缩边集呈典型凋亡改变、线粒体及内质网空泡样变、突触双层膜结构模糊;AD及AD+MF组尚可见神经原纤维缠结及脂褐素沉积等AD典型病变,但AD+MF组病变较AD组轻微,病变神经元数量较之减少;28d,MF组病变基本恢复,AD组病变未见恢复,AD+MF组较AD组部分恢复。(4)大鼠脑脊液、海马AD标志物改变:6h~28d,与C组比较,AD组大鼠脑脊液Aβ1-42含量均呈减少趋势,其中7d(P<0.01)、28d(P<0.05)具统计学差异;Tau含量则呈增高趋势,其中以6h(P<0.01)为显著;与AD组比较,AD+MF组脑脊液Aβ1-42含量呈增加趋势,其中以28d为显著(P<0.05),Tau含量则呈降低趋势,其中7d具显著性(P<0.05)。(5)大鼠海马蛋白表达改变:2-DE银染色结果显示,PF-MF暴露可改变AD大鼠海马蛋白质表达谱,经PD-QUEST软件分析筛选并经MALDI-TOF-MS鉴定PF-MF暴露差异敏感蛋白15个,其功能涉及突触信号传递、氧化应激、蛋白降解与聚集、能量代谢、炎性反应、脑损伤。其中,差异蛋白SNAP25——7d和28d在AD+MF组较C组、AD组均显著增高(P<0.01);UCH-L1——14d(P<0.05)及28d(P<0.01)在AD+MF组较C组和AD组均显著增高;EFHD2——6h在AD+MF组显著高于C组(P<0.05)和AD组(P<0.01),7d在AD组显著低于对照(P<0.05),28d在MF及AD+MF组均显著高于对照;MBP——7d在MF组较C组显著降低(P<0.01),28d在MF组(P<0.01)和AD组(P<0.05)显著减少但AD+MF组表达显著高于AD组(P<0.01)。(6)大鼠海马RKIP及NF-κB通路相关信号分子表达检测:RKIP——6h~28d在AD组表达呈增加-减少-恢复的改变,但AD+MF组表达在14d显著高于AD组(P<0.05);TAK1——6h在MF组表达显著减少;14d各组表达均较对照显著减少。P-IKK——6h在MF组表达显著增高,7d在AD+MF组显著降低,14d在AD和AD+MF组均显著增高。p-NF-κB——6h MF组表达显著增加但AD+MF组表达较AD组显著减少;7及14d各组达均显著增加,其中AD+MF组更高于AD组;28d仅见AD组仍然高于对照。RKIP与TAK1相互作用——6h~28d,AD组均显著减弱,MF组则表现为减弱→增强→再次减弱→再次增强的改变;与AD组比较,AD+MF组均显著增强。(7)PC12细胞病理改变:3h,C组细胞折光性良好突起丰富,各实验组均可见不同程度的折光性变差且突起减少;透射电镜下MF组可见核型不整,细胞器空泡样变,AD组凋亡发生并伴大量脂褐素沉积,AD+MF病变与AD组类似但程度较轻,病变细胞数量较少。(8)PC12细胞增殖和凋亡改变:MTT——3~12h,MF组增殖活力持续增高,AD组与C组比较则明显呈抑制状态。AD+MF组增殖活力在暴露终止3、6h,与C组未见显著差异,但12h时明显降低。AO/EB——3~12h各组凋亡率均显著高于对照,其中6h、12h可见AD+MF组凋亡率显著低于AD组。流式细胞术——3~12h,MF及AD组凋亡率均显著增高;其中6h、12h可见AD+MF组凋亡率显著低于AD组。(9)PC12细胞凋亡通路相关蛋白表达改变:Fas——3h在Aβ及AD+MF组显著上调,12h仅在AD组显著上调。TNFR1——仅于3h及6h在AD组显著增加。Caspase8——3~12h在Aβ及AD+MF组均呈上调趋势,其中以3h为显著。Caspase3——3h、6h各组均显著增加,12h仅AD组仍未见恢复。Cyt C——3~12h各组均显著增高,6h~12h MF组恢复,同时可见AD+MF组均显著低于AD组并与对照无差异。Bax、Bcl-2——3h,AD组Bax显著上调,同时AD+MF组Bcl-2表达显著高于AD组;12h,AD+MF组Bax表达显著低于AD组。3h、6h,AD组Bcl-2/Bax比值显著低于对照,但AD+MF组显著高于AD组。结论1、成功研制了动物及细胞PF-MF暴露实验装置,并应用该两种装置分别成功建立了PF-MF暴露联合AD大鼠模型和AD神经细胞模型。2、PF-MF暴露(50Hz-400u T 60d)可导致正常动物学习记忆功能和海马形态结构发生可恢复性损伤;PF-MF暴露(50Hz-100u T 24h)可促进正常神经细胞增殖同时增加其凋亡。3、PF-MF暴露(50Hz-400u T 60d)可改善AD动物学习记忆功能障碍,减轻海马形态结构损伤;PF-MF暴露(50Hz-100u T 24h)可促进AD细胞增殖,并抑制其凋亡。4、PF-MF延缓AD发生发展,减轻其功能结构和损伤的机制:(1)上调SNAP25、UCHL1、EFHD2、MBP表达,促进突触生长并改善神经元损伤;(2)上调RKIP及TAK1表达同时增加二者相互作用,抑制IKK磷酸化,进而抑制由NF-κB通路过度活化所致炎性损伤;(3)下调Caspase3、Cyt C、Bax表达,并上调Bcl-2表达,抑制细胞凋亡。上述机制提示,PF-MF改善AD病理生理损伤是多因素多途径综合作用的结果。综上,本研究通过整体实验与离体实验,明确了PF-MF暴露具有改善AD损伤的作用,并初步探讨了其分子机制,为AD防治提供新思路,具一定理论意义和潜在应用价值。