近年来,流感等呼吸道传染病频繁发生,如2005年爆发的H5N1禽流感、2009年的甲型H1N1流感大流行等,不仅造成了巨大的经济损失,也引起了极大的社会恐慌。如何预防流感等呼吸道传染病的蔓延仍是医药工作者面临的艰巨任务。流感等呼吸道传染病主要经呼吸道粘膜感染,而鼻粘膜是最先接触吸入性抗原物质的部位,因此鼻腔成为疫苗接种的最理想部位。鼻腔免疫可同时实现鼻粘膜免疫、远位粘膜免疫和系统免疫,尤其适用于预防流感等呼吸道传染病。季铵化壳聚糖纳米粒因具有生物相容性好、可穿透粘膜上皮、易被抗原提呈细胞(APC)识别等特点而广泛用作鼻腔免疫载体。但将抗原包封于季铵化壳聚糖纳米粒内部时常存在包封率较低、突释明显、抗原释放不完全等问题,使其免疫效果不理想。为了克服包封抗原存在的弊端,本课题构建了抗原共价结合的季铵化壳聚糖纳米粒,该纳米粒系统存在以下优势：①制备工艺简单,抗原利用率高(可达95%以上)；②抗原结合在纳米粒表面,给药后易被巨噬细胞等识别和摄取,激活免疫应答；③由于抗原与纳米粒是共价连接,在鼻腔转运过程中,抗原不易脱落,有利于提高抗原的颈部淋巴结转运,从而显著增强抗原的粘膜和系统免疫应答。此外,鼻腔内酶的种类和数量均较少,对外来抗原的破坏作用有限,为结合在纳米粒表面的抗原的鼻腔免疫提供了有利条件。相关研究国内外未见报道,具有较高的创新性。本文第一章主要是构建了模型抗原——卵白蛋白(OVA)结合的季铵化壳聚糖纳米粒(OVA-NP),并对其进行表征。实验首先利用壳聚糖与甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的自由基聚合反应合成了水溶性良好的季铵化壳聚糖(TMC),进而将TMC与3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯反应制得马来酰亚胺基-季铵化壳聚糖(Mal-TMC),核磁共振图谱和红外图谱验证结构正确。TMC和Mal-TMC的收率分别是78.7±3.5%和93.3±2.6%,壳聚糖季铵化程度为30.4±1.1%。以离子交联法制备了粒径为140 nm左右的空白纳米粒。利用Mal-TMC的马来酰亚胺基与巯基化OVA的巯基进行偶联反应,OVA可迅速、完全地结合到Mal-TMC纳米粒的表面。所得OVA-NP的平均粒径为1409 nm,Zeta电位为10.3mV。OVA-NP在低温条件下贮存具有较好的稳定性,并且在鼻粘膜匀浆中不易被破坏。本文第二章主要是考察了OVA-NP的颈淋巴结靶向性。实验采用Calu-3细胞单层模型考察了OVA-NP的跨鼻粘膜转运特性,发现其跨膜转运量与OVA溶液剂无显著性差异；采用Raw 264.7巨噬细胞考察免疫细胞对OVA-NP的识别和摄取能力,结果OVA-NP的细胞摄取量是溶液剂的6.7倍,并显著高于包封抗原的TMC纳米粒(NPe)组。采用1251放射标记法考察OVA-NP鼻腔给药后的体内分布,并与NPe、OVA与TMC物理混合物或共价结合物以及OVA溶液比较,结果发现,OVA-NP鼻腔给药后具有良好的浅表、颈深淋巴结靶向性,优于其他各组。其AUC0-4h分别是OVA溶液组的1.7和2.5倍,是NPe组的1.4和1.4倍。淋巴结靶向性指数LNTI)计算结果显示,OVA-NP组在浅表、颈深淋巴结的LNTI分别是溶液剂的2.5和3,2倍,是NPe组的1.5和1.5倍。本文第三章主要从系统免疫应答、粘膜免疫应答两方面考察了OVA-NP的鼻腔免疫效果。氢氧化铝吸附OVA疫苗肌注后可快速诱导高水平的系统免疫应答,但不能产生粘膜免疫应答。OVA-NP鼻腔免疫三次后,血中IgG、IgG1、IgG2a、IgA抗体水平显著增加,是NPe组的5.3～24.8倍,甚至较I.M.组更高；鼻洗液及肺灌洗液、唾液、阴道灌洗液中sIgA抗体水平也显著提高,其抗体滴度是NPe组的1.3-17.9倍。这些结果说明OVA-NP具有良好的鼻腔免疫效果,适合作为鼻腔免疫的载体。本文第四章主要探讨了OVA-NP鼻腔免疫后诱导免疫应答的机理。体外共孵育实验表明,OVA-NP可刺激Raw 264.7巨噬细胞释放IL-1p和IL-6、刺激小鼠脾淋巴细胞释放IL-2和IFN-γ, OVA-N P的免疫佐剂活性可能与此特性有关。OVA-NP鼻腔给药后主要通过腺体转运跨过鼻粘膜或通过M细胞摄取进入鼻相关淋巴组织(NALT),然后引流至颈部淋巴结产生免疫应答。采用免疫荧光法观察IgA型浆细胞在鼻腔中的分布,结果显示OVA-NP组免疫后鼻粘膜上产生的IgA型浆细胞数量最多,主要分布于固有层腺体的周围。NALT参与了OVA-NP鼻腔免疫后的粘膜和系统免疫应答,但不是主要的免疫效应部位,其主要作用可能是摄取纳米粒并引流至颈深淋巴结。本文第五章主要考察了OVA-NP的体内外安全性,为载体系统的进一步应用提供参考。Calu-3细胞毒性实验表明,OVA-NP在较高浓度时会对细胞的能量代谢产生影响,并使细胞膜通透性增加,可能是纳米粒以细胞膜扰动的方式进入细胞引起的。OVA-NP不易引起细胞内活性氧及丙二醛含量的增加,说明其不会造成细胞的脂质过氧化损伤。蟾蜍上腭纤毛摆动实验表明,OVA-N P未对纤毛摆动造成明显的影响。大鼠鼻腔连续三天给予OVA-NP后,鼻粘膜上皮结构完整,纤毛整齐浓密,说明OVA-NP对鼻粘膜没有明显的毒性。溶血实验表明,OVA-NP无明显的溶血作用。以上结果证明,制备的OVA-NP具有较好的体内外安全性,适合用作鼻腔免疫的载体系统。本文第六章构建了粒径为140 nm左右的甲型H1N1流感病毒抗原(H1N1)结合的TMC纳米粒(H1N1-NP)用于鼻腔免疫。制剂制备过程及鼻粘膜中的酶对HlN1-NP的抗原活性影响较小。小鼠鼻腔免疫三次后,H1N1-NP诱导了与肌注铝佐剂组水平相当的系统免疫应答及显著高于其它各组的粘膜免疫应答,说明将H1N1结合在TMC纳米粒表面可显著增加其鼻腔免疫原性。H1N1-NP也诱导了NALT分泌sIgA、IgG抗体,其变化趋势与鼻洗液中sIgA抗体、血中IgG抗体一致,说明NALT参与了H1N1-NP鼻腔免疫后的粘膜和系统免疫应答。血凝抑制试验证明,H1N1-NP诱导机体产生了有效抵抗H1N1流感病毒的保护性抗体。鼻粘膜毒性实验中,H1N1-NP对鼻粘膜细胞形态及纤毛无影响,表明其是安全的鼻用疫苗。综上,将抗原结合在TMC纳米粒表面作为鼻腔疫苗具有高效、安全的特点,显示出良好的应用潜力。