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2013年,H7N9亚型禽流感首次在中国长三角地区出现,迄今已在我国人群中形成了五波流行高峰。截至2020年3月1日,实验室确诊人感染H7N9禽流感病毒共有1568例病例,其中616人死亡,病死率约为40%。另外,根据世界动物卫生组织(World Orgnization For Animal Health,OIE)的报告,截至2018年3月,在中国家禽中已报告11起高致病性H7N9亚型禽流感暴发,导致将近100万只家禽被扑杀。因此,H7N9亚型禽流感是对公共卫生和家禽养殖的重大威胁。接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效手段。传统灭活疫苗依赖于鸡胚进行生产,具有诸如疫病暴发期间鸡胚供应不足、产生大量的废物引起环境污染、内源病毒污染等缺点。此外,灭活疫苗只能诱导抗体免疫,而不能诱导细胞免疫。因此,需要利用新的技术研发一种安全高效的H7N9禽流感疫苗,以满足现代化家禽养殖业疫病防控的需求。病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)是由携带病毒抗原的结构蛋白自行组装的非传染性颗粒,可模拟病毒粒子的天然结构,能激活细胞免疫反应和体液免疫反应,诱导的免疫保护更为全面。另外,利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产流感VLP疫苗,而且它由于不依赖鸡胚生产,保证了禽流感大流行时疫苗的充足供应,且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞悬浮培养平台,采用两种策略构建了表达H7N9禽流感病毒的血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)和基质蛋白(Matrix,M1)的VLP候选疫苗株。两种策略产生的候选VLP疫苗的抗原产量较高、免疫原性好、保护效力强,与商品化H7N9灭活疫苗的表现相当,为H7N9禽流感的防控提供了新的选择。1.基于单独表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究选取了一株 H7N9 亚型高致病性禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD1 5/2016(GD15)作为目的基因的供体。分别将 GD15 的 HA、NA、M1基因克隆在pVL1393载体上,通过与线性化的苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)基因组DNA共转染产生了三个重组杆状病毒(rBac-HA-GD15、rBac-NA-GD15、rBac-M1-GD15)。利用IFA方法能检测到外源蛋白的表达。将三个重组杆状病毒以MOI为1:1:1的比例共感染Sf9细胞。通过透射电镜可观察到直径80-120 nm、内部无遗传物质且与流感病毒结构相似的颗粒形成,即为H7N9 VLP(命名为VLP-1)。将VLP经超滤管浓缩后再经30-60%蔗糖密度梯度超速离心进行纯化,其血凝(HA)效价达到11 log2。分别收获超滤浓缩的VLP与超速离心纯化的VLP制备疫苗,同时以单独表达HA蛋白的重组杆状病毒rBac-HA-GD15制备的灭活疫苗为对照。疫苗经肌肉注射方式接种4周龄的SPF鸡,免疫后第3周各疫苗都能诱导产生抗体应答,平均血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)抗体滴度在6 log2以上;与对照组相比,各疫苗免疫鸡的血清中均能检测到中和抗体,纯化VLP-1组平均滴度能达到260;各疫苗组IgY抗体滴度均在2560以上,这些结果显示了 VLP-1疫苗具有较强的免疫原性。其中15 μg免疫剂量比7.5 μg免疫剂量能诱导更高的HI抗体水平。免疫3周后,用GD15毒株以106.0 EID50的剂量通过滴鼻点眼的方式攻毒。未免疫组在攻毒后出现严重的临床症状,且5天内全部死亡。所有疫苗免疫鸡在攻毒后14天内均未出现症状且未发生死亡,说明H7N9 VLP-1疫苗可提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,疫苗免疫后最高仅有30%的鸡能检测到排毒,且排毒量较低,其中纯化VLP-1组仅在攻毒后第3天能检测到排毒。组织病理学实验显示,VLP-1疫苗以15 μg剂量免疫时,H7N9病毒感染造成的肺脏病变明显较轻。以上结果说明,通过单独表达HA、NA和M1蛋白的重组杆状病毒共感染Sf9细胞可成功组装H7N9 VLP,且VLP-1疫苗能够诱导产生较强的抗体反应,能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护且显著抑制排毒。2.基于串联表达HA、NA、M1基因的重组杆状病毒组装H7N9 VLP疫苗的研究本研究将H7N9 GD15毒株的HA、NA和M1基因串联并克隆至穿梭载体中(pVL1393-NA-M1-HA)。将重组穿梭质粒与线性化的AcMNPV基因组DNA共转染Sf9细胞进行VLP的组装。利用IFA方法鉴定了 HA、NA与M1蛋白的表达,并用透射电镜观察到直径约为100 nm的流感病毒样颗粒,说明重组杆状病毒拯救成功且能够组装成H7N9VLP(命名为VLP-2)。重组杆状病毒接种Sf9细胞制备VLP,用超滤结合超速离心方法浓缩VLP,浓缩后VLP的HA效价显著提高(6 log2至11 1og2)。用两种构建策略制备的VLP疫苗(VLP-1与VLP-2)与商品化重组禽流感病毒H5+H7三价灭活疫苗进行动物的免疫与攻毒实验。VLP疫苗以15μg剂量肌肉注射4周龄的SPF鸡,第3周平均HI抗体滴度在6 log2以上,商品疫苗和VLP-1疫苗诱导的最高HI抗体均能达到10 log2以上。疫苗免疫血清与2013-2018年H7N9野毒株均具有良好的交叉反应性。各疫苗均能诱导中和抗体反应,但是VLP疫苗诱导的中和抗体比商品疫苗诱导的抗体略低。各疫苗均能诱导很高的IgY抗体水平(2560-5120),且VLP疫苗与灭活疫苗之间无显著差异。其中,VLP-2与VLP-1都以15 μg剂量免疫时,VLP-1疫苗诱导的抗体水平更高。免疫后第3周用高致病性H7N9禽流感病毒GD15株以106.0 EID50的剂量进行攻毒。临床观察14天内,各疫苗免疫组均未出现明显的临床症状且未发生死亡,说明VLP疫苗与商品疫苗均能提供100%的临床保护。攻毒后第3、5、7、9天采集喉头及泄殖腔棉拭子进行排毒检测,结果显示50%的商品疫苗免疫鸡能检测到排毒,两个VLP疫苗免疫鸡的排毒率分别为30%与40%,与商品化疫苗相比无显著差异。VLP疫苗与商品疫苗免疫鸡的脏器中均未检测到病毒,说明它们均能有效抑制病毒复制。以上结果说明,基于HA、NA、M1基因串联表达策略组装的H7N9 VLP疫苗能够在SPF鸡中诱导较强的抗体免疫应答,且能够提供针对H7N9病毒攻击完全的临床保护并显著抑制排毒及病毒在体内的复制,其免疫原性与保护效力与杆状病毒共感染组装的VLP-1疫苗及商品疫苗相当。