寻常性银屑病CD4+T淋巴细胞miRNA的异常表达与Th17型细胞因子相关及竹黄颗粒对其的干预作用

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目的:运用miRNA基因芯片技术检测寻常型银屑病(Psoriasis Vulgaris,PV)患者外周CD4+T淋巴细胞中小分子RNA(microRNAs, miRNAs)的表达谱系,筛选其与正常人CD4+T淋巴细胞中差异性表达的miRNAs,对部分差异性miRNAs进行荧光实时定量PCR (RealTime quantitative PCR,RT-qPCR)验证。进一步RT-qPCR检测PV患者外周血CD4+T淋巴细胞及皮损中miR-155, RORyt及IL-17的mRNA;基因表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Th17细胞相关细胞因子IL-17、IL-6、IL-23的血浆含量;同时研究竹黄颗粒治疗PV的临床疗效以及对miR-155和Th17细胞相关细胞因子表达的干预作用,探讨miRNAs和Thl7细胞相关细胞因子在PV中的作用机制,探索中医药治疗银屑病的作用新靶点,为中医药防治银屑病提供新的理论和实验依据。方法:1.采集4例PV患者和4例健康志愿者CD4+T淋巴细胞后,用Trizol法提取RNA,运用Affymetrix miRNA2.0芯片检测PV患者和正常人CD4+T淋巴细胞中miRNAs的表达谱系,运用聚类分析软件(cluster3.0)分析差异性表达的miRNAs.2.采集20例PV患者和10例健康志愿者CD4+T淋巴细胞,运用RT-qPCR方法对部分差异性miRNAs进行验证。3.采集24例PV患者和14例健康志愿者的血浆、CD4+T淋巴细胞及其中5例重度PV患者皮损与皮损周围组织,并以5例正常皮肤组织标本为对照,RT-qPCR检测外周血CD4+T淋巴细胞及皮损中miR-155、RORyt及IL-17的mRNA基因表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Thl7细胞相关细胞因子IL-17、IL-6、IL-23的血浆含量,分析银屑病miR-155和PV病情程度与Th17细胞因子的相关性。4.对24例PV患者应用竹黄颗粒治疗8周,采集患者治疗前后的CD4+T淋巴细胞和血浆,运用RT-qPCR技术检测外周血CD4+T淋巴细胞中miR-155、RORyt及IL-17的mRNA基因表达,ELISA检测Th17细胞相关细胞因子IL-17、IL-6、IL-23的血浆含量。分析竹黄颗粒对miR-155和Th17细胞相关因子的干预作用。结果:1.PV患者CD4+T淋巴细胞中有18个niRNA呈差异性表达,其中miR-155、miR-146a、miR-21、miR-31、miR-455-3p等13个明显上调(p<0.05),miR-99a、miR-125b、miR-203、miR-617、miR-23b共5个明显下调(p<0.05)。2.与正常人比较,PV患者CD4+T淋巴细胞中niR-155、miR-146a、miR-21、 miR-99a、miR-125b表达均上调,差异均有显著性意义(p<0.05),miR-99a、 miR-125b表达均下调,差异均有显著性意义(p<0.05),与miRNA基因芯片结果一致。3.与正常人比较,PV患者CD4+T细胞中:niR-155、RORγt及IL-17mRNA基因表达显著上调(p<0.05);PV患者血浆中IL-17、IL-6及IL-23的水平均显著高于健康对照者(p<0.05);与正常皮肤组织比较,PV患者皮损、皮损周围组织miR-155、 RORγt及IL-17mRNA基因表达水平有显著差异(p<0.05)。4.PV患者CD4+T细胞中miRNA-155的表达、IL-17血浆水平与PASI呈正相关(p<0.05),PV患者CD4+T细胞中miR-155表达水平与RORγt、IL-17mRNA表达水平及IL-17血浆含量均呈正相关(p<0.05)。5.竹黄颗粒治疗PV患者8周后,PASI积分明显下降,与治疗前比较差异有显著性意义(p<0.05),临床总有效率为79.17%。治疗结束后对CD4+T细胞中miR-155、RORγt及IL-17mRNA的基因表达与治疗前进行比较,miR-155、 IL-17mRNA表达显著下调(p<0.05);治疗结束后对Th17细胞因子IL-17、IL-6及IL-23血浆水平与治疗前进行比较,IL-17表达下调,差异有显著性意义(p<0.05)。结论:1.PV患者CD4+T淋巴细胞中miR-155、miR-146a、miR-21等13个miRNAs表达上调,miR-99a、miR-125b等5个miRNAs表达下调。18个差异性miRNAs可能在PV的发病机制中占有重要地位。2.PV患者CD4+T细胞及皮损中miR-155、RORyt及IL-17mRNA基因表达显著上调,血浆中IL-17、IL-6及IL-23的水平显著升高。miR-155与Th17细胞相关因子在PV的发病机制中有重要意义。3.miRNA-155基因表达及IL-17血浆水平与PV皮损症状严重程度密切相关,可以作为判断病情和临床疗效的生物学指标之一。4.竹黄颗粒治疗PV疗效显著,它可能是通过调节miRNA-155、IL-17的表达水平而发挥作用机制。
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