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糖尿病肾病是导致终末期肾衰竭的主要原因,是当前最重要的公共卫生问题之一,给卫生系统带来了巨大负担。目前糖尿病肾病的治疗主要是通过阻断肾素-血管紧张素系统,如口服血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI)/血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker,ARB)类药物。与ACEI/ARB类药物单用相比,联用可增强降低蛋白尿作用,但并不能延缓肾脏疾病进展。雷公藤多苷(tripterygium glycosides,TG)片是从雷公藤根中提取的总苷制成的片剂,在临床上常用于治疗肾病综合征等,并被纳入糖尿病肾病治疗规范。但雷公藤多苷片除了具有肾脏保护和抗炎等作用,还具有肝毒性和肾毒性,临床用药方案存在争议。为此,本论文研究雷公藤多苷片在糖尿病肾病大鼠体内的量-效-毒关系,为制定临床合理用药方案提供参考。首先建立雷公藤多苷片中4种活性成分血药浓度测定方法;其次构建糖尿病肾病大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组,6.25 mg·kg-1 TG组(根据临床1 mg·kg-1·d-1剂量换算),12.5 mg·kg-1 TG组,25 mg·kg-1 TG组和50 mg·kg-1 TG组,同时设正常组;测定不同给药时间的疗效指标,如单侧肾指数(unilateral renal index,URI)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,Scr)和肌酐消除率(creatinine clearance,Ccr),以及毒性指标,如内氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST);然后通过蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测肾脏和肝脏微管相关蛋白轻链3B(microtubule-associated protein light chain 3 beta,LC3B)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3K)、蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白表达情况,免疫荧光法检测溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane glycoprotein 1,LAMP1)和 LC3 蛋 白荧光表达情况,分析其量-效关系及其作用机制,以及量-毒关系及其作用机制;测定各组大鼠体内雷公藤多苷片中4种活性成分的血药浓度,分析量-效-毒关系及其体内效毒物质基础。具体研究结果如下:(1)雷公藤多苷片血药浓度测定方法研究通过UPLC-Q Extractive联用技术建立了同时测定血浆样品中雷公藤内酯醇、雷公藤红素、雷公藤内酯酮和雷公藤酯甲含量的方法。血浆样本处理时采用乙酸乙酯沉淀蛋白,乙腈复溶。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 ×100 mm,1.7μm),流动相为甲醇-0.3%甲酸水溶液梯度洗脱,流速0.2 mL·min-1,柱温40℃,进样体积2μL。采用电喷雾(ESI)正离子模式进行全扫描,扫描范围200～700m/z。该方法专属性良好,内源性物质对4种成分均无明显干扰。雷公藤内酯醇在0.0125～3.2 ng·mL-1线性关系良好(r=0.9993),批内、批间精密度分别为4.580%～7.706%,8.155%～9.191%,批内、批间准确度分别为85.367%～111.538%,103.958%～107.609%;雷公藤红素在0.1719～44 ng·mL-1线性关系良好(r=0.9981),批内、批间精密度分别为3.154%～8.996%,8.572%～12.025%;批内、批间准确度分别为94.252%～114.098%,99.956%～108.576%,雷公藤内酯酮在0.00625～1.6 ng·mL-1线性关系良好(r=0.9990),批内、批间精密度分别为0.800%～9.591%,6.270%～14.162%,批内、批间准确度分别为 89.076%～107.817%,99.681%～107.311%,雷公藤酯甲在0.7656～196 ng·mL-1线性关系良好(r=0.9995),批内、批间精密度分别为3.094%～4.152%,7.166%～10.708%,批内、批间准确度分别为98.488%～103.163%,101.429%～104.476%。各成分提取回收率在50%以上,基质效应在70%左右,稳定性RSD值在15%以内。(2)雷公藤多苷片在糖尿病肾病大鼠体内的量-效关系及其作用机制研究与正常组比较,给药1、2、4和8周时模型组的URI、BUN、Scr显著降低(P<0.05),Ccr显著升高(P<0.05),肾脏病理情况逐渐恶化,肾小球数量增多,肾小球增大,肾小球基底膜增厚和系膜扩张,第8周出现肾小管的空泡变性,肾脏的LC3B蛋白表达显著降低,PI3K、Akt和mTOR表达显著升高,LAMP1和LC3蛋白表达减弱。与模型组相比,6.25 mg·kg-1 TG组第4周Scr显著降低(P<0.05),Ccr显著升高(P<0.05);第8周时BUN显著降低(P<0.05),肾脏病理情况有所改善,肾脏LC3B表达增强,PI3K、Akt和mTOR蛋白表达降低,LAMP1和LC3蛋白表达增强。50 mg·kg-1 TG组第1周Ccr显著升高(P<0.05),第2周BUN和Scr显著降低(P<0.05),Ccr显著升高(P<0.05),肾脏病理情况有所改善,但第8周时Ccr显著降低(P<0.05),且肾脏自噬活性有所降低,LAMP1和LC3蛋白表达减弱。发现50 mg·kg-1 TG组在给药早期(1、2周)、6.25 mg·kg-1 TG组在长期(4、8周)给药时,可改善肾功能指标,改善肾脏病理情况,保护肾脏。但高剂量随着时间延长,肾功能指标有所下降。雷公藤多苷片肾脏保护作用随给药剂量与时间的变化可能与影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,调节自噬有关。(3)雷公藤多苷片在糖尿病肾病大鼠体内的量-毒关系及作用机制研究与正常组相比,模型组ALT和AST无明显差异,肝脏病理情况无明显差异;与模型组相比,6.25 mg·kg-1 TG组ALT和AST无显著差异;12.5 mg·kg-1 TG组2周时ALT和AST显著升高(P<0.05),部分肝细胞索排列紊乱;25 mg·kg-1 TG组给药2和4周ALT和AST显著升高(P<0.05),肝细胞索逐步排列紊乱,肝细胞肿胀;50 mg-kg-1 TG组给药2、4和8周时ALT和AST显著升高(P<0.05),肝细胞索排列逐步紊乱,肝细胞肿胀,肝窦内出现炎性细胞浸润。给药8周时,与正常组比较,模型组LC3B蛋白表达显著降低(P<0.05),PI3K、Akt和mTOR蛋白表达显著升高(P<0.05),LAMP1和LC3蛋白荧光表达明显减弱;与模型组比较,随着给药剂量增加,LC3B蛋白表达逐渐降低,PI3K、Akt和mTOR蛋白表达逐渐升高,LAMP1和LC3蛋白荧光表达逐渐降低,且50 mg·kg-1 TG组LC3B蛋白表达显著降低(P<0.05),PI3K、Akt和mTOR蛋白表达显著升高(P<0.05)。这表明剂量大于12.5mg·kg·d-1给药2周及以上可产生肝毒性,这可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活,从而抑制自噬有关。另是否可以通过联合mTOR抑制剂,以促进自噬,减轻毒副作用,值得深入研究。(4)雷公藤多苷片在糖尿病肾病大鼠体内血药浓度及量-效-毒关系研究通过同时测定各组大鼠体内雷公藤多苷片4种活性成分的血药浓度发现,血中雷公藤内酯醇、雷公藤内酯酮和雷公藤酯甲浓度低于定量下限,血中雷公藤红素浓度与效毒具有关联性。6.25 mg·kg-1TG组在给药4、8周可改善肾功能,发挥肾脏保护作用,延缓糖尿病肾病进展,血中雷公藤红素浓度在2～4 ng·mL-1左右,12.5 mg·kg-1 TG组在给药2周产生肝毒性,血中雷公藤红素浓度为7.1 ng·mL-1;25 mg·kg-1 TG组在给药2、4周产生肝毒性,血中雷公藤红素浓度大8 ng·mL-1;50 mg·kg-1 TG组给药1、2周对肾脏产生保护作用,2、4和8周产生肝毒性,血中霄公藤红素浓度大于7 ng·mL-1。这提示雷公藤红素血药浓度可反映雷公藤多苷片在糖尿病肾病大鼠体内效毒情况,雷公藤红素在体内安全范围大约在2～7 ng·mL-1,当血中药物浓度大于7 ng·mL-1超过2周时,肝毒性产生。本文研究发现雷公藤多苷片在糖尿病肾病大鼠体内存在量-效-毒关系,6.25 mg·kg-1(临床剂量1 mg·kg-1·d-1)TG在给药4～8周,50 mg·kg-1 TG给药1～2周可产生肾脏保护作用;当给药剂量超过12.5 mg·kg-1,给药时间超过2周可产生肝毒性;雷公藤红素在体内安全范围大约在2～7 ng·mL-1,当血中药物浓度大于7 ng·mL-1,时间超过2周时,肝毒性产生;其效毒作用可能与雷公藤多苷片通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬活性有关。这提示临床治疗糖尿病肾病长期用药(雷公藤多苷片)时建议使用常用剂量(1 mg·kg-1·d-1);若需根据患者机体情况调整短期内多倍量用药,建议时间不超过2周,同时密切监测肝、肾功能,防止不良反应发生。另当给药时间大于8周时,其量-效关系有待进一步研究;是否可以通过联合mTOR抑制剂,以促进自噬,减轻雷公藤多苷片毒副作用,值得深入研究。