近几年新出现的亚临界流体萃取技术，可以在比较低的压力下实现比较好的萃取效果，克服了超临界CO₂萃取存在的一些缺点，因而受到了越来越多的重视。由于1,1,1,2-四氟乙烷（R134a）具有临界条件（Tc=101.1℃，Pc=4.06MPa）易于达到、低毒、惰性、不易燃以及不破坏臭氧层（ODP=0）等特点，所以成为亚临界流体的首选。蛋白同化类激素，能促进畜禽生长，提高饲料转化率，有利于蛋白质的沉积，提高产量，而被用于水产养殖行业。但蛋白同化激素在动物食品中的残留可能会危及消费者的健康，具有潜在的致癌性。但由于利益驱动，一些同化激素仍然被一些养殖户偷偷使用，因此建立可靠、快速、方便、绿色的分析方法对水产品中激素残留量进行监控是很有必要的。本文通过建立亚临界R134a萃取-高效液相色谱连用技术对鱼肉中激素残留检测进行了研究。论文通过设计正交试验和响应曲面，用亚临界R134a流体萃取罗非鱼肌肉中的丙酸睾酮、甲基睾酮和醋酸甲羟孕酮残留，经过传统液-液萃取和C18固相萃取小柱除杂，然后用高效液相色谱仪检测。探讨了萃取压力、萃取温度、萃取时间、共溶剂用量等多种因素对激素回收率的影响作用，并对不同种类的性激素，进行了萃取条件的优化选择。实验结果如下：1.用正交试验优化了亚临界R134a萃取鱼肉中丙酸睾酮残留，甲醇收集液用石油醚脱脂纯化，然后用高效液相色谱仪检测。得到最佳的实验条件：萃取压力14MPa，萃取温度23℃，R134a流量10g/min，静态萃取30min，动态萃取40min，共溶剂甲醇添加量2mL，收集液为甲醇。根据极差大小，可以判断各因素对丙酸睾酮回收率的影响程度，因素的主次关系为：萃取压力＞动态萃取时间＞萃取温度。在最优条件下，方法灵敏度高，重现性好，检出限为2.0μg/kg，丙酸睾酮的加标回收率均大于90%、相对标准偏差（RSD）小于5%。2.用响应曲面优化了亚临界R134a萃取鱼肉中甲基睾酮残留，甲醇收集液用C18固相萃取小柱纯化，然后用高效液相色谱仪检测。得到最佳的实验条件：萃取压力5MPa、萃取温度31℃、共溶剂甲醇用量3.35mL、静态萃取30min，动态萃取40min，R134a流量10g/min。在最优条件下，方法灵敏度高，重现性好，检出限为5.0μg/kg，甲基睾酮的加标回收率均大于90%，RSD小于3%。通过对模型的分析发现，共溶剂甲醇用量极显著，萃取压力和萃取温度显著，二次项萃取压力和共溶剂用量显著，萃取压力和共溶剂用量的交互作用显著。3.用响应曲面优化了亚临界R134a萃取鱼肉中醋酸甲羟孕酮残留，甲醇收集液用C₁₈固相萃取小柱纯化，然后用高效液相色谱仪检测。得到最佳的实验条件：萃取压力3MPa、萃取温度25℃、共溶剂甲醇用量6mL、静态萃取30min，动态萃取40min，R134a流量10g/min。在最优实验条件下，方法灵敏度高，重现性好，检出限为5.0μg/kg，醋酸甲羟孕酮的加标回收率均大于95%，RSD小于5%。通过对模型的分析发现，共溶剂甲醇用量极显著，萃取压力和共溶剂用量的交互作用以及萃取温度和共溶剂用量的交互作用显著。本方法在国内外首次利用亚临界R134a萃取作为兽药残留分析样品的前处理技术，相比于超临界CO₂萃取，萃取压力和萃取温度都比较低，易于大规模推广应用。整个亚临界R134a萃取过程只需1h左右，有机溶剂用量仅为常规方法的1/10，与常规方法比较，本方法具有萃取和分离同步完成，操作周期短，分析效率高，环境污染少，分析结果准确、可靠等特点。